Analisi di linee cellulari esprimenti la NOS endoteliale

3 RIASSUNTO La NO sintasi endoteliale (eNOS) è un enzima soggetto ad una complessa regolazione dovuta a modificazioni post-traduzionali, come la fosforilazione e la acilazione e ad interazioni con altre proteine, come la caveolina. Per facilitare lo studio della biologia di questo enzima, abbiamo generato delle linee HeLa esprimenti in modo inducibile la eNOS bovina. E' stato utilizzato il sistema Tet-off, consistente in una linea cellulare ospite che esprime stabilmente un transattivatore (tTa) inibito dalla tetraciclina o dal suo analogo, la doxiciclina. Un cDNA codificante per la eNOS è stato subclonato nel vettore responsivo pUHD10-3, sotto il controllo di un promotore dipendente da tTA. Il plasmide risultante pUHD10-3/eNOS è stato utilizzato per transfettare cellule HeLa Tet-off insieme ad un plasmide che conferisce resistenza alla igromicina. Sono stati selezionati 30 cloni resistenti, di cui 5 esprimevano la eNOS in maniera inducibile. Di questi, due sono stati analizzati approfonditamente, mediante Western blot, immunofluorescenza ed istochimica. Ambedue i cloni mostravano una bassa espressione di eNOS quando coltivate in presenza di doxiciclina, espressione che veniva aumentata di circa 100 volte dopo rimozione dell'antibiotico. L'espressione dell'enzima aumentava gradatamente in risposta all'abbassamento delle concentrazioni di doxiciclina nel mezzo di coltura da 0,1 a 0,001 ng/ml. La cinetica di induzione era abbastanza rapida, con un aumento della espressione rilevabile già a 4 ore dalla rimozione di doxiciclina. L'analisi con immunofluorescenza ha dimostrato che la eNOS transfettata si localizza in superficie e a livello del complesso del Golgi. Tale localizzazione è stata confermata anche con un saggio istochimico per l'attività diaforasica della eNOS. Non è stato invece possibile dimostrare una colocalizzazione della eNOS con la caveolina. Le due linee cellulari descritte in questa tesi dovrebbero rappresentare un ottimo strumento per studi futuri sulla regolazione e sugli effetti biologici della eNOS.