Il legame degli amminoacidi al tRNA

Le molecole di tRNA cui è attaccato un amminoacido sono dette cariche, mentre i tRNA privi di amminoacido sono detti scarichi. Il caricamento richiede la formazione di un legame acilico tra il gruppo carbossile dell'amminoacido ed il gruppo 2' o 3' dell'adenosina che protrude dallo stelo accettore. Questo legame acilico è considerato ad alta energia, perché la sua idrolisi, quindi la rottura del legame, causa una variazione elevata di energia libera che viene, successivamente, utilizzata nella formazione del legame peptidico, che lega tra loro gli amminoacidi. Comunque, tutte le amminoacil-tRNA sintetasi attaccano un amminoacido ad un tRNA in due passaggi. Il primo è l'adenililazione, in cui l'amminoacido reagisce con l'ATP e diventa adenilato, con il contemporaneo rilascio di pirofosfato. Il secondo passaggio è il caricamento del tRNA, in cui l'amminoacido adenilato, che rimane strettamente legato alla sintetasi, reagisce con il tRNA. Il risultato netto di questa reazione è il trasferimento dell'amminoacido all'estremità 3' del tRNA attraverso il gruppo idrossilico in posizione 2' (se agisce una tRNA sintetasi della classe I) o 3' (se agisce una tRNA sintetasi della classe II) ed il simultaneo rilascio di AMP. In questo modo, ciascuno dei 20 amminoacidi viene legato all'appropriato tRNA da una singola tRNA sintetasi specifica. Dato che la maggior parte degli amminoacidi è specificata da più di un codone, non è infrequente che una sintetasi riconosca e carichi più di un tRNA (noti come tRNA isoaccettori). I determinanti della specificità sono raggruppati sul tRNA in due siti distanti tra loro: lo stelo accettore e l'ansa dell'anticodone. Entrambe queste parti vengono spesso riconosciute dalle amminoacil-tRNA sintetasi, per contribuire a discriminare i diversi amminoacidi, anche se lo stelo accettore è sicuramente quello con la maggiore importante anche perché, come sappiamo, un singolo amminoacido può essere prodotto dal riconoscimento di diversi codoni.
Quindi, il compito che le amminoacil-tRNA sintetasi devono affrontare nel selezionare l'amminoacido appropriato è forse ancora più impegnativo del riconoscere il tRNA corretto. Il motivo è dato dalle piccole dimensioni degli amminoacidi e, talvolta, dalla loro somiglianza. Nonostante ciò la frequenza di errori nel caricamento è molto bassa; generalmente soltanto 1 su 1000 tRNA viene caricato con un amminoacido errato. In alcuni casi è facile capire come tale accuratezza venga ottenuta, come nel caso della cisteina e del triptofano che hanno dimensioni, forme e gruppi chimici sostanzialmente diversi. In altri casi, invece come per l'isoleucina e la valina, che differiscono solo per un gruppo metilico, è più difficile. La valil-tRNA sintetasi è in grado di escludere, a causa dell'ingombro sterico, l'isoleucina dal suo sito catalitico, perché quest'ultima è più grande. Per contro, la valina dovrebbe facilmente inserirsi nel sito catalitico dell'isoleucil-tRNA sintetasi. Per questo motivo, l'isoleucil-tRNA sintetasi possiede, in prossimità del sito catalitico (per l'adenililazione), un sito di “correzione” (costituito da un profondo solco dell'enzima), che permette di rettificare il prodotto della reazione di adenililazione. L'AMP-valina può essere contenuta in questo sito, nel quale viene idrolizzata e rilasciata in forma di valina e AMP liberi. La molecola di AMP-isoleucina, invece, è troppo grande per entrare nel sito di correzione e, pertanto, non è soggetta ad idrolisi. Tutti questi controlli sono dovuti al fatto che una volta che il tRNA è stato caricato non viene fatto nessun controllo ulteriore. In altre parole, il ribosoma accetta “a scatola chiusa” qualsiasi tRNA carico che sia in grado di formare un'appropriata interazione codone-anticodone, che esso porti o meno l'amminoacido corretto. Un esperimento biochimico dimostra il fatto che il ribosoma riconosce il tRNA, ma non l'amminoacido che esso porta. Consideriamo, per esempio, il tRNA carico cistenil-tRNACys (si ricordi che il prefisso indica l'amminoacido, mentre l'apice identifica il tRNA). La cisteina legata al cistenil-tRNACys può essere convertita in alanina per riduzione chimica, a dare alanil-tRNACys. Quando viene aggiunto ad un estratto crudo in grado di compiere la sintesi proteica, la molecola di alanil-tRNACys introdurrà un'alanina in corrispondenza dei codoni che specificano la cisteina.