Funzioni biologiche della ricombinazione sito-specifica

Le cellule e i virus fanno uso della ricombinazione conservativa sito-specifica per una grande varietà di funzioni biologiche. In alcuni casi inseriscono il proprio DNA nel cromosoma ospite. In altri casi, la ricombinazione sito-specifica è usata per alterare l'espressione genica o per aiutare a mantenere l'integrità strutturale di molecole di DNA circolare durante la replicazione del DNA, la ricombinazione omologa e la divisione cellulare. Comunque, il confronto di diversi sistemi di ricombinazione sito-specifica mostra alcune caratteristiche generali. Tutte le reazioni dipendono strettamente dall'assemblaggio delle ricombinasi sul DNA e dall'avvicinamento dei due siti di ricombinazione. Per alcune reazioni questo assemblaggio è estremamente facile in quanto richiede solamente la ricombinasi e le sue sequenze di riconoscimento sul DNA, mentre altre reazioni richiedono proteine accessorie. Quest'ultime, dette proteine architettoniche, legano specifiche sequenze di DNA, curvando la doppia elica, quindi stimolando la ricombinazione. Le stesse proteine possono anche controllare la direzione della ricombinazione, per esempio assicurando che avvenga l'integrazione di un segmento di DNA e non la reazione inversa, ossia la sua escissione.
Quando il batteriofago λ infetta un batterio, una serie di eventi regolativi porta o all'instaurarsi di uno stato lisogenico quiescente o alla moltiplicazione fagica, in un processo detto crescita litica. Nel primo stato si deve avere l'integrazione del DNA fagico nel cromosoma ospite, e allo stesso modo, nella crescita litica, pre replicarsi il fago deve escindere il proprio DNA dal cromosoma ospite. In dettaglio, per l'integrazione, l'integrasi di λ (λInt) catalizza la ricombinazione tra due siti specifici, noti come siti di attacco, o att. Il sito attP si trova sul DNA fagico ed il sito attB sul cromosoma batterico. λint è una ricombinasi in tirosina, e il meccanismo di scambio del filamento è analogo a quello descritto per la proteina Cre. Al contrario però di quest'ultima, l'integrazione di λ richiede l'utilizzo di proteine accessorie che aiutano ad assemblare il complesso proteina-DNA. Importante, inoltre, per la regolazione dell'integrazione di λ è l'organizzazione altamente simmetrica dei siti attP e attB. Entrambi sono caratterizzati da un core centrale (lungo circa 30 bp), che consiste in due siti di legame per λInt e dalla regione del crossing over dove avviene lo scambio. Mentre attB consiste solo di questo core centrale, attP è molto più lungo (240 bp) ed è caratterizzato da molti altri siti di legame per proteine che si estendono in entrambi i “bracci”. λInt è, invece, una proteina anomala, perché contiene due domini responsabili del legame sequenza-specifico al DNA: uno di questi si lega ai siti di riconoscimento presenti sulle braccia e l'altro a quelli presenti sulle regioni core. Comunque, l'integrazione richiede attB, attP e λInt e una proteina architettonica chiamata fattore d'integrazione dell'ospite (integration host factor, IHF). Quest'ultimo è una proteina che lega il DNA del fago in maniera sequenza specifica, capace di determinare sulla doppia elica una curvatura. La funzione del fattore di integrazione dell'ospite è di avvicinare i siti per λInt, presenti sulle braccia, a quelli presenti sul core centrale. Quando la ricombinazione ha termina, il genoma fagico circolare è stabilmente integrato nel cromosoma ospite. Come risultato, sulle giunzioni tra le sequenze del fago e quelle dell'ospite si sono formati due nuovi siti ibridi. Questi siti sono detti attL (left, sinistra) e attR (right, destra). Entrambi i siti contengono la regione core, ma le due braccia sono ora separati. Per la ricombinazione di escissione, invece, è essenziale un'altra proteina architettonica detta Xis (da excise) che si lega a specifiche sequenze di DNA e introduce una curvatura nella doppia elica, proprio come IHF. Xis riconosce due motivi di sequenza presenti su di un braccio di attR. Il legame a questi siti introduce una grande curvatura e insieme, Xis, λInt e IHF stimolano l'escissione attraverso la formazione di un complesso nucleoproteico attivo su attR. Questo complesso può ora interagire produttivamente con le proteine assemblate su attL, permettendo la ricombinazione. Bisogna infine ricordare che, oltre a stimolare l'escissione (la ricombinazione tra attL e attR), il legame di Xis al DNA inibisce anche l'integrazione (la ricombinazione tra attP e attB). La doppia attività di Xis, come cofattore di stimolazione dell'escissione e inibitore dell'integrazione, assicura che il genoma del fago sia separato, e resti separato, dal cromosoma batterico quando Xis è presente.
Nella Salmonella, invece, la ricombinasi Hin inverte un segmento di cromosoma batterico per permettere l'espressione di due set di geni alternativi. Queste reazioni in genere servono a “pre-adattare” una parte della popolazione ad un rapido cambiamento ambientale, nel caso dell'inversione Hin, la ricombinazione permette al batterio di evitare il sistema immunitario dell'ospite. I geni controllati dal processo d'inversione codificano per due forme diverse di flagellina (dette H1 e H2) che è la componente proteica del filamento flagellare. I flagelli come sappiamo sono strutture utili alla mobilità ma anche, molto spesso, motivi riconosciuti dal sistema immunitario. La regione cromosomica invertita d Hin è di circa 1000 bp ed è fiancheggiata da specifici siti per la ricombinazione detti hixL (sulla sinistra) e hixR (sulla destra). Queste sequenze hanno un orientamento invertito una rispetto all'altra. Hin è una ricombinasi in serina che induce l'inversione usando lo stesso meccanismo di base precedentemente descritto per gli enzimi di questa famiglia. Il segmento invertibile contiene il gene che codifica per Hin, così come il promotore, che in un orientamento è posto in modo tale da permettere l'espressione dei geni posizionati al di fuori del segmento invertibile. Quindi, quando il segmento invertibile è nell'orientamento “acceso”, questi geni, adiacenti, sono espressi; al contrario, quando il segmento è girato nell'orientamento “spento”, i geni non possono essere trascritti perché privi del promotore. I due geni sotto il controllo del promotore “che gira” sono fljB, che codifica per la flagellina H2, e fljA, che codifica per un repressore trascrizionale del gene per la flagellina H1. Perciò, nell'orientamento “acceso” sono espressi la flagellina H2 ed il repressore di H1. Queste cellule hanno sulla loro superficie esclusivamente flagelli del tipo H2. Nell'orientamento “spento”, invece, sono sono sintetizzati né H2 né il repressore di H1 e, quindi, si ha la presenza di flagelli del tipo H1. Hin per ricombinare richiede, oltre ai siti hix, una sequenza aggiuntiva. Questa corta sequenza è un enhancer che aumenta la frequenza di ricombinazione. Come gli enhancer che amplificano i livelli trascrizionali, tale sequenza può funzionare anche quando si trova piuttosto lontana dai siti di ricombinazione, ma comunque, necessita sempre di una proteina batterica detta Fis (da factor for inversion stimulation). Come l'IHS, anche Fis è una proteina che curva il DNA in una posizione specifica e media delle interazioni proteina-proteina con Hin, importanti per attuare la ricombinazione. Quando Fis attiva Hin, i tre siti di DNA (hixL, hixR e l'enhancer) vengono avvicinati grazie al superavvolgimento negativo del DNA, che stabilizza l'associazione di questi tre siti lontani (complesso dell'invertosoma). In questo modo può avvenire la ricombinazione solamente tra i siti hix che si trovano sulla stessa molecola di DNA.