Misurazione della crescita microbica - diretta

Esistono differenti metodi per contare il numero delle cellule o per valutare la massa cellulare. Quelli più utilizzati sono la conta totale e la conta vitale. Il numero di cellule di una popolazione può essere determinato mediante conta diretta al microscopio. Tale tipo di conta può essere fatto sia su campioni essiccati su un vetrino sia su campioni sospesi in un liquido. In quest'ultimo caso, però, è necessario l'impiego di speciali camere di conta, nelle quali il vetrino di superficie è inciso con un reticolo quadrettato di cui è nota l'aria di ogni riquadro. Dato che lo spessore tra il reticolo e il vetrino coprioggetto è noto, è possibile determinare il volume di sospensione batterica contenuta in ogni riquadro. In pratica, il numero di cellule presenti in ogni riquadro del reticolo è contato al microscopio; tale valore è poi convertito in numero di cellule per millimetro di sospensione semplicemente moltiplicando per un fattore di conversione basato sul volume della camera. I limiti di questa conta sono: l'impossibilità di distinguere le cellule vive da quelle morte, l'impossibilità di identificare cellule molto piccole, la difficoltà di ottenere stime precise e la difficoltà di conteggio a bassa densità. Come quindi ben si è capito, in una conta diretta al microscopio si contano sia le cellule vive che quelle morte; tuttavia, dato che in molti casi si è interessati a contare solo le cellule vive, si ricorre a metodi di conta vitale. Si definisce vitale una cellula capace di dividersi e dare origine a una progenie. Comunemente, una conta vitale consiste nel determinare il numero delle cellule di un campione in grado di formare colonie su un opportuno terreno agarizzato; per tale motivo la conta vitale è spesso chiamata conta in piastra o conta delle colonie. Il presupposto di questo tipo di procedura è che ogni colonia sia originata da una singola cellula vitale. Vi sono due metodi per eseguire una conta in piastra: il piastramento in superficie e il piastramento per inclusione. Nel piastramento in superficie, un volume noto di una coltura opportunamente diluita, viene distribuito, con una spatola di vetro sterile, sopra la superficie di un terreno agarizzato. La piastra viene poi incubata fino alla comparsa delle colonie che vengono quindi contate. Nel piastramento per inclusione, invece, un volume noto di coltura è pipettato in una piastra di Petri sterile; viene poi aggiunto un terreno agarizzato fuso e il tutto viene mescolato facendo ruotare delicatamente la piastra sul banco di lavoro. In questo metodo le colonie si formeranno all'interno della piastra e non solo, come nel metodo di piastramento in superficie, sulla superficie dell'agar. La piastra deve essere poi esaminata attentamente per essere sicuri di contare tutte le colonie. Comunque in tutte e due i tipi di piastramento è importante che il numero di colonie che si sviluppano su una piastra non sia troppo elevato. Infatti un eccessivo affollamento porterebbe a un conteggio sottostimato, così come anche un numero piccolo di colonie. La pratica corrente, per ovviare a questi problemi, consiste nel contare le piastre che contengono un numero di colonie tra 30 e 300. Invece, per ottenere un numero di colonie appropriato, molto spesso il campione da contare deve essere diluito. Poiché raramente si conosce in anticipo il numero delle cellule vitali, di solito è necessario effettuare più diluizioni, utilizzando comunemente una serie di diluizioni scalari in base dieci. I limiti della conta vitale sono: non tutte le colonie si sviluppano con la stessa velocità e quindi se l'incubazione è breve il numero sarà sottostimato, colonie di dimensioni molto ridotte possono essere invisibili e i batteri non coltivabili verranno esclusi dalla conta. E' necessario ricordare che due o più cellule che rimangono aggregate daranno origine a una sola colonia, rendendo la conta vitale sottostimata. Per definire più chiaramente il tipo di risultato ottenuto, la conta vitale viene spesso espressa come numero di unità formanti colonia (CFU, colony-forming units), piuttosto che come numero di cellule vitali, in quanto un'unità formante colonia può essere costituita da una o più cellule.