Organizzazione della struttura completa della proteina

ORDINAMENTO DEI FRAMMENTI PEPTIDICI
Stabilita la sequenza dei frammenti peptidici, ci resta da stabilire l'ordine con cui essi sono legati nel polipeptide originale. Possiamo ottenere questo ordine confrontando le sequenze amminoacidiche di un gruppo di frammenti peptidici con quelle di un altro gruppo di frammenti peptidici, prodotti con un sistema di rottura diverso dal primo, i cui punti di rottura si possano sovrapporre a quelli della prima serie. Le regioni di sovrapposizione devono essere sufficientemente lunghe da non consentire statisticamente errori in queste disposizioni.
POSIZIONE DEI PONTI DISOLFURO
La tappa finale dell'analisi della sequenza amminoacidica è quella che consente la determinazione della posizione dei ponti disolfuro (se ve ne sono). É possibile ottenere ciò rompendo un campione di proteina nativa, con i suoi ponti disolfuro intatti, in modo da ottenere coppie di frammenti peptidici contenenti ognuno un singolo residuo di Cys impegnato in un legame disolfuro. Questi peptidi possono essere identificati mediante elettroforesi diagonale. Con questa tecnica il digerito viene sottoposto ad un elettroforesi bidimensionale con due procedimenti uguali. Dopo la prima corsa, l'elettroforetogramma viene esposto a vapori di acido performico che ossidano i residui di cistina ad acido cisteico. Dopo la seconda corsa elettroforetica quei frammenti peptidici che sono disposti sulla diagonale dell'elettroforetogramma, e quindi non sono stati modificati dal trattamento con acido performico, non contengono legami disolfuro. Quei frammenti che originalmente contenevano un ponte disolfuro ed erano formati da due peptidi vengono rotti dal trattamento con acido performico e quindi migrano in modo diverso nella seconda corsa elettroforetica, spostandosi dalla diagonale. Dopo aver isolato il frammento polipeptidico contenente il ponte disolfuro, quest'ultimo viene rotto e viene determinata la sequenza dei due peptidi. La posizione dei ponti disolfuro viene stabilita confrontando la sequenza amminoacidica di questi frammenti polipeptidici con quella della proteina.