Gli enzimi del ciclo dell'acido citrico

CITRATO SINTASI
La citrato sintasi catalizza la condensazione dell'acetil-CoA con l'ossalacetato. La reazione di questo enzima procede con un meccanismo cinetico sequenziale ordinato, in cui l'ossalacetato si lega all'enzima prima dell'acetil-CoA. La struttura ai raggi X della citrato sintasi mostra che l'enzima è in una forma aperta, in cui i due domini di ciascuna subunità creano una profonda fessura che contiene il sito di legame per l'ossalacetato. In seguito al legame per l'ossalacetato, il dominio più piccolo ruota rispetto al dominio più grande, determinando la chiusura della fessura. In questo modo, il cambio conformazionale indotto dal legame dell'ossalacetato genera il sito di legame per l'acetil-CoA e nasconde completamente l'ossalacetato legato al solvente. La reazione della citrato sintasi è una condensazione mista aldolo-estere di Claisen, che ha luogo in tre tappe:
1.Un residuo di His dell'enzima, agendo come una base, genera un carbanione sull'acetil-CoA;
2.Il carbanione dell'acetil-CoA attacca nucleofilicamente il gruppo carbonilico dell'ossalacetato. Il prodotto della reazione, il citril-CoA, resta legato all'enzima;
3.Il citril-CoA si idrolizza a citrato e CoA.

ACONITASI
L'aconitasi catalizza l'isomerizzazione reversibile del citrato e dell'isocitrato, attraverso la formazione dell'intermedio cis-aconitato. Il citrato essendo una molecola prochiralica, l'aconitasi può distinguere tra i gruppi carbossimetilici pro-S e pro-R del citrato. La formazione dell'intermedio cis-aconitato avviene mediante una deidratazione in cui una base dell'enzima sottrae il protone pro-R dal C(2) del gruppo carbossimetilico pro-R del citrato. Questo fatto è seguito dalla perdita del gruppo OH a livello del C(3) in una transeliminazione che forma l'intermedio cis-aconitato. L'aconitasi contiene nella sua molecola un centro ferro-zolfo[4Fe—4S], che è necessario per la sua attività catalitica. Uno degli atomi di Fe(II) del centro Fe-S si pensa si coordini con il gruppo OH del substrato in modo da facilitarne l'eliminazione. La seconda fase della reazione dell'aconitasi è la reidratazione del doppio legame del cis-aconitato per formare isocitrato.

ISOCITRATO DEIDROGENASI NAD+-DIPENDENTE
L'isocitrato deidrogenasi catalizza la decarbossilazione ossidativa dell'isocitrato ad α-chetoglutarato per produrre la prima molecola di CO2 del ciclo e contemporaneamente la prima molecola di NADH. I tessuti dei mammiferi contengono due forme diverse di questo enzima. Una forma partecipa al ciclo dell'acido citrico, è localizzata internamente nei mitocondri ed utilizza NAD+ come cofattore. L'altra forma è presente sia nei mitocondri che nel citosol ed utilizza NADP+ come cofattore. L'isocitrato deidrogenasi NAD+ dipendente, che richiede Mg2+ ed Mn2+ come cofattori, catalizza l'ossidazione di un alcool secondario (isocitrato) a chetone (ossalosuccinato), seguita dalla decarbossilazione del gruppo carbossilico β del chetone.

α-CHETOGLUTARATO DEIDROGENASI
L'α-chetoglutarato deidrogenasi catalizza la decarbossilazione ossidativa di un α-chetoacido (l'α-chetoglutarato), generando la seconda molecola di CO2 del ciclo dell'acido citrico e NADH. La reazione coinvolge un complesso enzimatico analogo alla piruvato deidrogenasi, costituito da: α-chetoglutarato deidrogenasi (E1), diidrolipoil transsuccinilasi (E2) e diidrolipoil deidrogenasi (E3). Le singole reazioni catalizzate dal complesso avvengono con meccanismi identici a quelli delle reazioni del complesso della piruvato deidrogenasi; il prodotto, in questo caso il succinil-CoA, è un tioestere ad “alta energia”.

SUCCINIL-CoA SINTETASI
La succinil-CoA sintetasi idrolizza il composto ad “alta energia” succinil-CoA con una sintesi accoppiata di un nucleotide trifosfato ad “alta energia”. La reazione avviene in tre tappe:
1.Il succinil-CoA reagisce con il Pi formando succinil fosfato e CoA;
2.Il gruppo fosforico del succinil fosfato viene trasferito ad un residuo di His dell'enzima ed il succinato viene rilasciato;
3.Il gruppo fosforico sull'enzima viene trasferito al GDP, formando GTP.
Notare che in ognuna di queste tappe viene conservata l'energia libera di idrolisi del succinil-CoA mediante la formazione sequenziale di composti ad “alta energia”: prima il succinil fosfato, poi un residuo di 3-fosfo-His ed infine GTP. Giunti a questo punto, un'unità acetile è stata completamente ossidata a CO2. Sono state generate inoltre due molecole di NADH ed una di GTP (equivalente ad una di ATP). Per completare ora il ciclo, il succinato deve essere convertito di nuovo in ossalacetato. La restante parte del ciclo, le ultime tre reazioni, ha proprio questa funzione.

SUCCINATO DEIDROGENASI
La succinato deidrogenasi catalizza la deidrogenazione stereospecifica del succinato a fumarato. (Questo enzima è fortemente inibito dal malonato, un analogo strutturale del succinato e un classico esempio di inibitore competitivo, ricordare che l'inibizione della respirazione da parte del malonato fu una delle osservazioni che portarono Krebs ad ipotizzare il ciclo dell'acido citrico). La succinato deidrogenasi contiene un gruppo FAD, l'accettore di elettroni della reazione. In genere, il FAD funziona biochimicamente nella ossidazione di alcani e alcheni, mentre il NAD+ ossida alcoli ad aldeidi o chetoni. Questa differenza è dovuta al fatto che l'ossidazione di un alcano (come il succinato) ad un alchene (come il fumarato) è sufficientemente esoergonica da ridurre il FAD a FADH2, ma non abbastanza da ridurre il NAD+ a NADH.

FUMARASI
La fumarasi (fumarato idratasi) catalizza l'idratazione del doppio legame del fumarato, formando S-malato (L-malato).

MALATO DEIDROGENASI
La malato deidrogenasi catalizza la reazione finale del ciclo dell'acido citrico, la rigenerazione dell'ossalacetato. La formazione avviene attraverso l'ossidazione del gruppo ossidrilico del malato a gruppo chetonico, in una reazione che dipende dalla presenza del NAD+. Lo ione idruro rilasciato dall'alcol in questa reazione viene trasferito alla faccia re del NAD+, la stessa faccia su cui agisce la lattato deidrogenasi e l'alcol deidrogenasi.