Marcatori: PCR

Consente di sintetizzare ripetutamente (amplificare) per via enzimatica uno specifico segmento di DNA situato tra due regioni di sequenza nucleotidica nota, producendone un numero elevato di copie attraverso una serie di reazioni di:
-denaturazione (95°C) -appaiamento degli inneschi (primer) (40-68°C) -polimerizzazione dei nuovi frammenti ad opera della Taq Polimerasi (72 °C). Ci sono milioni di diversi geni o sequenze all’interno di un campione di DNA.
Viene selezionata una sequenza specifica da amplificare (quella rossa nello schema).Questa sequenza può essere un qualsiasi gene o una zona non codificante del DNA.
Per copiare un particolare gene è necessario conoscere la sequenza fiancheggiante (in genere questa è una sequenza corta) su ogni lato della zona che deve essere amplificata.
Questa regione (quella blue nello schema) permetterà al primer di attaccarsi. Sarà quindi possibile l’inizio di copiatura del segmento di DNA scelto.
Piccole sequenze di DNA, disegnate per accoppiarsi con il DNA genomico in uno specifico sito di attacco, in modo da coadiuvare il legame della DNA polimerasi nella zona desiderata.
In assenza del primer che si attacca al sito specifico, la DNA polimerasi non è in grado di copiare il filamento di DNA
Per costruire il nuovo blocco di DNA, sono necessari anche i nucleotidi trifosfato, ognuno dei quali è costituito da: una base (adenina, timina, citosina o guanina) uno zucchero e tre fosfati. La PCR richiede diversi cicli di amplificazione. Ogni ciclo consiste di tre diverse temperature: la temperatura iniziale (94°C) permette ai due filamenti di DNA di separarsi; la temperatura intermedia (50-60°C), o di annealing, permette al primer di legarsi alla sequenza complementare sul DNA mentre la temperatura finale (72°C), o di estensione permette alla DNA polimerasi di attaccarsi al primer e quindi di copiare i filamenti di DNA.
Dopo aver estratto il DNA e effettuato la PCR facciamo l’elettroforesi, una Tecnica che permette di visualizzare e separare acidi nucleici e proteine
I frammenti di DNA migrano attraverso un materiale selettivo (es. gel di agarosio) che li separa in base alle dimensioni (peso molecolare/lunghezza); frammenti più piccoli migrano attraverso le maglie del gel più velocemente, quelli più grandi si muovono più lentamente. Per l’elettroforesi capillare Il principio è lo stesso dell’elettroforesi “classica”: i frammenti di DNA migrano attraverso una resina selettiva all’interno di un capillare che li separa in base alle dimensioni (peso molecolare/lunghezza); frammenti più piccoli migrano attraverso le maglie della resina più velocemente, escono prima dal capillare e vengono intercettati per primi dal sistema di rivelazione.
Tale dispositivo emette un raggio luminoso che colpisce i frammenti di DNA che, se marcati con molecole fluorescenti, a loro volta emettono un segnale in uscita che viene registrato. Il risultato è un elettroferogramma. L’intensità del segnale dipende dalla quantità di frammento e determina l’area e l’altezza dei picchi