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______________________________________________________________________ 3
Figura 2. Ciclo visivo della vitamina A.
La vitamina A riveste inoltre un ruolo fondamentale nella crescita delle ossa, nella
riproduzione e nello sviluppo embrionale. Viene coinvolta nel preservare l’integrità
funzionale e strutturale delle cellule epiteliali dell’organismo e nel regolare la risposta del
sistema immunitario in seguito a infezioni virali, batteriche e parassitarie.
La retinaldeide (RALD) è una molecola estremamente reattiva e instabile, è localizzata
prevalentemente nel tessuto oculare dove è deputata al mantenimento della funzione visiva
>2 ≅.
L’acido retinoico (RA) che deriva dall’ossidazione completa del retinolo a livello
intracellulare, è il retinoide biologicamente più attivo e potente; l’isomero all-trans
(tretinoina) sembra essere la forma attiva in tutti i tessuti tranne la retina >3 ≅. In molti
sistemi in vitro è risultato essere da 10 a 100 volte più potente del suo precursore.
Condivide alcune azioni del retinolo, ma non tutte, non è, infatti, efficace nel ripristinare le
funzioni visive e riproduttive, tuttavia è molto potente nel promuovere la crescita, nel
controllare il differenziamento e il mantenimento del tessuto epiteliale.
Queste azioni possono essere attribuite a modificazioni che avvengono a livello della
trascrizione nucleare. L’acido all-trans retinoico influenza l’espressione di quei geni
coinvolti appunto nella proliferazione cellulare. Esplica tale azione combinandosi con
particolari recettori nucleari (RAR, retinoic acid receptors) che attiva diversi geni, tre di
essi indicati come ∆, Ε e ϑ sono stati localizzati nei cromosomi umani 17, 3 e 12
rispettivamente. Essi possiedono sei distinti domini strutturali (A-F) i quali mostrano una
forte omologia di sequenza tra loro sia per quanto riguarda il loro legame al DNA che nel
dominio che si lega all’acido retinoico e appartengono ad una superfamiglia che
comprende recettori per gli ormoni stereoidei e tiroidei >4 ≅.
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Nel 1990 alla superfamiglia è stato aggiunto un altro gruppo di recettori chiamati RXR
(retinoid X receptors), tuttavia presentano una bassa omologia di sequenza amminoacidica
nei confronti delle RAR >5 ≅. Il ligando endogeno di questi recettori è l’acido 9-cis retinoico
che li lega con elevata affinità (K
diss
= 10nM) e risulta essere un potente attivatore
trascrizionale >6 ≅. L’attivazione genica comporta il legame del complesso RAR-ligando a
specifiche sequenze di DNA localizzate a monte del gene bersaglio seguito dalla
dimerizzazione con un complesso costituito da RXR e il proprio ligando. La presenza di
una zona a monte di un gene seleziona quale tra i possibili eterodimeri si possono legare e
di conseguenza il tipo di modulazione trascrizionale (positiva o negativa) indotta sul gene
bersaglio >7 ≅ (Figura 3).
Figura 3. Azioni dell’acido all-trans retinoico legato a RARs. (1)Attivazione della
trascrizione di geni mediante legame a sequenze enhancers. (2) Repressione del fattore di
trascrizione AP-1, responsabile della divisione cellulare e della produzione di
metalloproteine che permettono la migrazione cellulare.
Visti i loro effetti sul tessuto epiteliale, i retinoidi e loro analoghi sono usati per via topica
in numerose dermatosi, per esempio per curare alcune forme di psoriasi e per la pelle
fotodannegiata da UV grazie alla capacità di ridurre il turn-over cellulare e regolarizzare il
differenziamento della cute e per via orale in forme gravi di acne (acne vulgaris, acne
nodulocistica) >8 ≅. Tuttavia le più importanti applicazioni terapeutiche tuttora in fase di
studio riguardano il possibile uso di queste sostanze nella profilassi dei tumori e nel trattare
varie condizioni precancerose >9 ≅. La carenza di retinolo (vitamina A) fa aumentare la
suscettibilità alla cangerogenesi; le cellule basali di diversi tipi di tessuti epiteliali,
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diventano iperplastiche e il differenziamento cellulare diminuisce. La somministrazione di
retinolo e di altri retinoidi, fa regredire queste modificazioni nell’epitelio delle vie
respiratorie, nelle ghiandole mammarie, nella vescica e nella pelle. Il meccanismo
dell’attività anticangerogena potrebbe essere l’induzione del differenziamento delle cellule
tumorali a formare cellule normali morfologicamente mature. La morte programmata delle
cellule (apoptosi) può essere considerata un particolare fenomeno differenziativo, che
sembra essere mediata, in tessuti adulti ed embrionali, da endonucleasi Ca
++
/Mg
++
dipendenti. L’acido retinoico induce questo processo in tessuto mesenchimale di embrioni
di topo, in granulociti neutrofili cresciuti in vitro, o in alcune linee cellulari tumorali, tra le
quali le cellule leucemiche HL-60 >10 ≅. Inoltre, i retinoidi regolano la sintesi di proteine
specifiche (es.cheratine) necessarie per il differenziamento dell’epitelio ed ha una funzione
biochimica specifica nella sintesi delle glicoproteine e dei glicolipidi posti sulla superficie
della cellula che possono essere coinvolti nell’adesione e nella comunicazione cellulare. La
trasformazione del retinolo a retinilfosfato nelle cellule epiteliali è seguita dalla formazione
microsomiale di mannosil retinilfosfato, un retinolo glicosilato, che media il trasferimento
di mannosio a glicoproteine specifiche di superficie. La carenza di vitamina A comporta
una brusca diminuzione nella sintesi di queste proteine >11 ≅. L’acido retinoico è stato usato
per promuovere il differenziamento delle cellule leucemiche in pazienti con leucemia
promielocitica acuta, ma a causa delle sue proprietà farmacocinetiche non favorevoli (t
1/2
di 30 min e una bassa biodisponibilità) la remissione è di breve durata >12 ≅. L’acido 9-cis
retinoico, un retinoide naturale scoperto recentemente, può legarsi e attivare selettivamente
i recettori RXR, producendo lo stesso effetto terapeutico e, alcune differenze nelle
proprietà farmacocinetiche, fanno pensare ad un suo possibile uso >13 ≅.
Tabella 1. Proteine trasportatrici di retinoidi.
Binding Protein Retinoide legato Localizzazione
RBP All-trans retinolo Fegato, tessuti extraepatici
CRBP I All-trans retinolo Ubiquitaria: fegato, reni, milza, occhi
CRBP II All-trans retinolo Piccolo intestino
CRABP I Acido all-trans retinoico Ubiquitaria:vescicole seminali, occhi,
pelle, vas deferens
CRABP II Acido all-trans retinoico Pelle
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______________________________________________________________________ 6
Assorbimento e Metabolismo.
Più del 90% del retinolo è assunto attraverso la dieta come estere, generalmente retinil
palmitato e come carotenoide sotto forma di all-trans Ε-carotene. La maggior parte degli
esteri del retinolo viene idrolizzata dagli enzimi pancreatici nel lume intestinale e
nell’orletto a spazzola delle cellule della membrana epiteliale dell’intestino, prima
dell’assorbimento >14 ≅ (Figura 4). Anche se il retinolo è lipofilo, la sua incorporazione
nelle cellule epiteliali avviene attraverso un processo mediato da una proteina
citoplasmatica carrier chiamata CRBP II (cellular retinol-binding protein type II ) che lo
lega in modo specifico e con una affinità di 10 nM. Essa si trova solo nelle cellule
dell’intestino tenue dove costituisce circa l’1% delle proteine solubili totali. In queste
cellule il retinolo viene nella maggior parte riesterificato a palmitato e incorporato nei
chilomicroni. Attraverso l’internalizzazione nei chilomicroni, la maggior parte degli esteri
del retinolo viene incorporata nel fegato >15 ≅. Prima di passare dal fegato al circolo, gli
esteri del retinolo epatici sono idrolizzati e il 90-95% del retinolo così prodotto si lega ad
una ∆
1
-globulina, una proteina plasmatica che ha siti di legame per il retinolo, chiamata
RBP (retinol-binding protein). Questa proteina viene sintetizzata dal fegato e circola nel
sangue complessata e stabilizzata dalla transtiretina, una pre-albumina che lega la tiroxina
formando un complesso in rapporto 2:2:1 >16 ≅. La formazione di questo complesso
protegge la RBP circolante e il suo ligando dal metabolismo e dall’escrezione renale. Il
retinolo legato al complesso RBP-TTR raggiunge le membrane cellulari di vari organi
bersaglio dove si suppone venga rilasciato dalla RBP plasmatica e diffonda attraverso le
membrane cellulari legandosi direttamente alla proteina intracellulare apo-CRBP I
(cellular retinol binding protein type I) all’interno dei tessuti, mediante un processo la cui
velocità è determinata dalla concentrazione di accettore in forma apo (in assenza di
ligando) >17 ≅. La CRBP I è una proteina presente nella maggior parte dei tessuti, e oltre al
ruolo svolto nell’incorporazione del retinolo all’interno delle cellule, la CRBP I serve ad
indirizzare il metabolismo del proprio ligando, promuovendone l’accesso ad enzimi
specifici mediato da un riconoscimento selettivo proteina-proteina. In determinati tessuti
bersaglio il retinolo viene ossidato ad acido retinoico che a sua volta è complessato con
altre proteine citoplasmatiche le CRABP I e CRABP II (cellular retinoic acid-binding
protein type I and II), che lo indirizzano ai recettori nucleari RAR e RXR >18 ≅. Le quantità
di acido retinoico assunte con la dieta sono pressoché trascurabili. Esso è prodotto in situ e
non è stato evidenziato un organo produttore primario di acido retinoico, non è stato isolato
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______________________________________________________________________ 7
ß-CAROTENE
RETINOLO
RE
ACIDI
GRASSI
CHILOMICRONI
RE
RE
Chilomicroni
Sistema
linfatico
RE
RETINOLO
Accumulo RE
RETINOLO
+
RBP
ACIDI
GRASSI
NUCLEO
Plasma
TTR-RBP
RETINOLO
RA
RETINOLO
(CRBP)
RE
un trasportatore plasmatico specifico e i suoi livelli plasmatici sono mediamente di due
ordini di grandezza inferiori di quelli misurati nei tessuti >19 ≅.
Figura 4. Trasporto e Metabolismo della vitamina A.
Caratteristiche strutturali delle iLBP
S .
Queste proteine citoplasmatiche e la proteina extracellulare RBP (retinoil binding protein)
appartengono ad una estesa famiglia di proteine a basso peso molecolare conosciute con il
nome di LBP
s
(lipid-binding proteins) e sono adibite al trasporto di ligandi liposolubili.
Le LBP
s
comprendono due distinte categorie: le intracellular lipid binding proteins (iLBP)
e le extracellular lipid binding proteins (eLBP) >18 ≅ (Tabella 2).
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Tabella 2. Proteine appartenenti alla famiglia delle LBP
s
.
Lipid-binding proteins Acronimo
Intracellulari
Adipocyte lipid-binding protein ALBP
Myelin P2 protein P2
Keratinocyte lipid-binding protein MAL-I
Heart fatty acid-binding protein HFABP
Mammary-derived growth inhibitor MDGI
Shark fatty acid-binding protein SRK FABP
Cellular retinoic-binding protein II CRABPII
Cellular retinoic-binding protein I CRABPI
Cellular retinol-binding protein II CRBPII
Cellular retinol-binding protein I CRBP I
Intestinal fatty acid-binding protein IFABP
Manduca sexta fatty acid-binding protein MFB1
Manduca sexta fatty acid-binding protein II MFB2
Gastrotropin (ileal lipid-binding protein) GAST
Intestinal fatty acid-binding protein II IFABP2
Schistosoma mansoni Intestinal fatty SFABP
acid-binding protein.
Liver fatty acid-binding protein LFABP
Extracellulari
Serum retinol-binding protein RBP
Ε-Lactoglobulin Ε-LG
Pieris brassicae bilin-binding protein p-BBP
Manduca sexta bilin-binding protein m-BBP
Urinary ∆-2globulin A2U
Major urinary protein MUP
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Le sequenze amminoacidiche e le strutture tridimensionali risolte mediante cristallografia a
raggi X hanno permesso di evidenziare un’identità a livello di struttura primaria e
conformazionale variabile dal 40% al 80%.
Le iLBP
s
possiedono circa 130 amminoacidi disposti in modo tale da dare origine ad una
struttura a singolo dominio molto semplice e piuttosto compatta: 10 foglietti Ε antiparalleli
costituiscono la caratteristica struttura a Ε-barrel, in cui l’j-esima catena forma una serie di
legami a idrogeno con la (j-1)-esima e la (j 1)-esima catena, portando alla chiusura della
struttura avente dimensione di circa 25x35x40 Å >18 ≅. Ogni foglietto è collegato al
successivo tramite stretti tratti di connessione chiamati “turns”, ad eccezione dei primi due,
che invece presentano un tipico motivo strutturale “elica-turn-elica” (Figura 5).
Figura 5. Rappresentazione della conformazione delle iLBP. Struttura del Ε-barrel e
avvolgimento delle due ∆-eliche ( ∆
1
e ∆
2
) che si trovano vicino ai gruppi amminici. Le
catene sono denominate con le lettere dalla A alla J.
La catena Ε-A coinvolta in questo motivo ha degli elementi strutturali importanti ai fini del
corretto avvolgimento delle proteine. Tale catena possiede, a livello della parte centrale, un
attorcigliamento causato da un rigonfiamento tipico di questo tipo di struttura, e metà della
catena si predispone perpendicolarmente all’altra metà permettendo la formazione di
legami a idrogeno con le catene Ε-B e Ε-J. Inoltre, contiene un tratto di sequenza, comune
a tutte le iLBP
s
e eLBP
s
, dato da Gly-X-Trp, che svolge un compito cruciale nella
dinamica di folding di queste proteine >20 ≅.
Di particolare interesse sono le diverse interazioni che coinvolgono il residuo di Trp in
posizione 8. L’anello aromatico si trova schiacciato a “sandwich” fra le catene laterali
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______________________________________________________________________ 10
amminoacidiche Ε-I e Ε-J e un residuo basico, generalmente Arginina, appartenente
all’ultima catena del Ε-barrel.
Studi di mutagenesi a carico della proteina ALBP a livello del Trp in posizione 8, sostituito
con un residuo di Phe o Tyr, hanno reso tale proteina insolubile in ambiente acquoso,
mentre sostituzioni analoghe, coinvolgenti un residuo di Trp in posizione 98, hanno
conferito invece una maggiore solubilità. A livello della catena Ε-A altri residui
amminoacidici diversi dal Trp potrebbero essere coinvolti in significativi cambiamenti
conformazionali. Le iLBP
s
contengono infatti 9-11 residui di glicina e più dell’80% di
esse, poiché prive di catena laterale, presentano valori positivi dell’angolo di torsione ∴ tra
l’azoto peptidico e l’atomo di carbonio. In particolare, risulta importante il residuo di
glicina in posizione 6; infatti, qualsiasi altro tipo di amminoacido avente una catena
laterale in questa posizione potrebbe interferire con il residuo di Trp occupante la
posizione 8.
Angoli ∴ positivi si riscontrano in altri tipi di amminoacidi diversi dalla glicina, specie in
residui che contengono Asn/Asp, ed è una caratteristica ricorrente in questa famiglia di
proteine >21 ≅. La catena laterale del residuo di Arginina situata a livello di questa catena e
a livello della catena Ε-I forma legami ad idrogeno con gli atomi della catena carbonilica
principale all’inizio di Ε-J che corrisponde ad una Thr123. Inoltre, in posizione 4 esiste la
preferenza per un residuo idrofobico (solitamente Phe/Tyr nelle iLBP
S
ma più variabile
nelle eLBP
S
) in grado di interagire con le catene laterali degli amminoacidi, costituenti le
catene C-terminali del Ε-barrel >22 ≅.
Comune a tutte le iLBP
s
è la presenza tra le catene Ε-D e Ε-E di una “gap-region” priva di
legami a idrogeno e in grado di conferire a queste proteine una certa flessibilità
conformazionale. L’analisi conformazionale in questa porzione della proteina ha
evidenziato la presenza di una molecola di acqua, dalla quale nasce un’estesa serie di
legami ad idrogeno caratterizzante il Ε-barrel. L’esistenza di questa regione probabilmente
è da attribuirsi ad una ridotta lunghezza delle due catene ( Ε-D e Ε-E), poiché nella RBP tali
catene hanno lunghezze maggiori e non si rivela alcuna “gap-region”. In prossimità della
parte inferiore di questa zona si riscontra una regione a carattere apolare, costituita da
amminoacidi appartenenti alle catene idrofobiche laterali. In particolare sono presenti due
residui altamente conservati di fenilalanina in posizione 64 e 70, un residuo di valina in
posizione 49 e un’isoleucina in posizione 84.
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______________________________________________________________________ 11
I foglietti Ε sono curvati e ruotati in modo tale da creare una cavità interna, sito
responsabile dell’interazione con il ligando lipofilo. Al contrario di quanto ci si
aspetterebbe, questa cavità è costituita da un largo numero di catene laterali aventi residui
amminoacidici idrofili e ionizzabili implicati in un’estesa rete di legami elettrostatici e
legami idrogeno e da un core idrofobico formato da otto delle dieci catene laterali e
coinvolgenti i residui amminoacidici 4 e 91. Il carattere apolare si estende fino a formare
una specie di arco responsabile dello scheletro vero e proprio della proteina. La maggior
parte delle strutture cristalline hanno rivelato che una parte del volume di questa cavità
pari a 174 Å, viene occupato da molecole di acqua, che si distribuiscono in modo ordinato
e formano legami a idrogeno oltre che tra loro anche con residui polari, inoltre alcune di
loro sembrano essere approssimativamente situate in siti analoghi a livello delle varie
proteine. Queste proteine risultano essere in parte accessibili alle molecole di solvente e,
nonostante alcune di loro presentino piccoli pori sufficientemente larghi da permettere
l’ingresso di molecole di acqua, nessuno di questi appare sufficientemente largo per
consentire l’entrata delle molecole di legando. In posizione 13 e 126 sono stati individuati
alcuni residui polari conservati, implicati a formare una zona idrofila in prossimità del sito
di legame.
Per diverse proteine (ALBP, P
2
, MFB
2
) si è riscontrato che alla posizione 126 adiacente al
residuo in posizione 13 corrisponde generalmente un residuo di Arg. La struttura a Ε-barrel
delimita l’accesso al sito di legame non con la separazione che sussiste tra le catene Ε-D e
Ε-E,come sarebbe ragionevole pensare data la presenza di quattro rivolti l’interno(Phe-
70,Glu-72, Thr/Leu74 e Ala75/Ile77) a chiudere la cavità, ma bensì da due ∆-eliche aventi
la medesima lunghezza in tutte le iLBP
s
e carattere antipatico con residui interni
idrofobico. Tali eliche sono in grado di interagire sia con il retinoide sia con residui polari
carichi sia si espongono verso l’esterno per interagire con le molecole di solvente. Esse
assumono una conformazione più rigida rispetto a quella che adottano, quando non è
presente il ligando. Tale variazione conformazionale avvalora l’ipotesi che, a questo
livello, potrebbero verificarsi evidenti modificazioni strutturali, tali da consentire
un’apertura della molecola. In prossimità dell’elica ∆
Ε
in corrispondenza della parte C-
terminale si sono riscontrati dei residui basici in posizione 130 e 137, che non
interagiscono con alcun residuo amminoacidico a livello della struttura primaria, ma che
sono tuttavia esposti al solvente. Un’ipotesi avanzata suppone che il residuo 130 sia
implicato in un’interazione con il Trp-8.
________________________________________________________________Introduzione
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Le eLBP
s
possiedono, analogamente alle iLBP
s,
catene Ε-antiparallele (otto invece che
dieci), una cavità interna responsabile del legame con il ligando lipofilo, ma sono prive
delle “gap-region” e del motivo elica-turn-elica.
Fra tutte le proteine appartenenti alla famiglia delle iLBP
s,
tra cui le proteine che sono state
oggetto di studio in questo lavoro di tesi, si possono evidenziare analogie a livello della
struttura terziaria (presenza del Ε-barrel), della “gap-region”, del motivo elica-turn-elica,
della cavità interna e numerosi sono anche i residui amminoacidici che si conservano a
livello della struttura primaria >18 ≅.
Tabella 3. Amminoacidi che si mantengono nelle iLBP
S
.
Idrofobico Idrofili Turns
Phe-4 Gly-6 Polare 45
Tyr-Trp
8
Polare 9 Gly-46
Non polare 10 Polare 12 Polare 47
Tyr-Phe
16
Polare 13 Gly-67
Non polare 19 Ionizzabile 14
Met-Leu
20
Asn-15
Non polare 23 Ionizzabile 21
Non polare 33 Polare 31
Non polare 42 Polare 37
Polare 55
Non polare 49 Polare 58
Phe-Cys
70
Polare 69
Phe-64 Polare 71
Non polare 66 Polare 81
Non polare 84 Polare 112
Non polare 86 Polare 125
Non polare 124 Polare 126
Tyr-Phe
128
Polare 130
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Cellular Retinol-binding Proteins.
La CRBP I e la CRBP II sono proteine di 14-15 KDa
aventi 134 residui amminoacidici.
Possiedono un’identità di sequenza pari al 56% e questa struttura primaria risulta essere
altamente conservata tra le diverse specie animali (95-97%) >23-24 ≅. Tuttavia, differiscono
per il diverso ruolo fisiologico svolto e per una diversa affinità di legame nei confronti
dell’all-trans retinolo, il 13-cis retinolo e l’all-trans retinaldeide.
In condizioni di basse concentrazioni di all-trans retinolo, è stato evidenziato, mediante
studi NMR del
19
F applicati alle due proteine derivatizzate con 6-fluorotriptofano, che il
retinolo complessate CRBP II è prontamente trasferito a CRBP I, mentre il retinolo
complessate CRBP I non viene trasferito alla CRBP II, ciò sta ad indicare una maggiore
affinità di CRBP I per il retinolo; il sito di legame relativo alla CRBP I sarà più popolato
rispetto a quello della CRBP II. Questi risultati renderebbero ragione del fatto che la CRBP
II, presente a livello del tessuto intestinale, deve poter rilasciare facilmente il ligando per
permetterne la distribuzione ai vari tessuti. Per quanto riguarda il legame con l’all-trans
retinaldeide, mentre la CRBP I mostra un affinità 100 volte superiore per l’alcol, la CRBP
II lega in ugual misura i due ligandi. Per gli altri isomeri del retinolo e in particolare per il
9-cis, 11-cis retinolo e per l’acido all-trans retinoico sia la CRBP I che la CRBP II non
mostrano alcuna affinità per essi, tuttavia dimostrano di avere una certa preferenza nel
complessare il 13-cis retinolo >25-26 ≅.
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