Caratterizzazione strutturale dell'inibitore delle chinasi ciclino dipendenti p27

  
1. INTRODUZIONE
 
 
 1.1 Il ciclo cellulare  
 
Negli eucarioti le cellule somatiche vanno normalmente incontro ad 
eventi duplicazionali; da una singola cellula madre, attraverso 
un�ordinata sequenza di eventi, si ottengono due cellule figlie con lo 
stesso corredo cromosomico della cellula progenitrice. L�evento fisico 
della divisione nucleare viene chiamato mitosi. 
Il termine ciclo cellulare � comunemente usato per indicare il periodo 
di tempo che va dalla formazione della cellula, come prodotto di una 
mitosi, fino al completamento della sua divisione in due cellule figlie. 
Il ciclo cellulare si articola in 4 fasi: la fase G
1
 (6-12 ore) (Fig-1.) 
durante la quale sono sintetizzati RNA e proteine; la fase S (6-8 ore) 
che rappresenta il periodo di tempo necessario affinch� tutto il DNA 
della cellula sia duplicato; la fase G
2
 (3-4 ore) che copre la transizione 
dalla fase S alla mitosi ed infine la mitosi (M) stessa. Ognuna di 
queste fasi � caratterizzata da numerosi eventi che si susseguono in 
maniera estremamente ordinata, grazie ad un sistema di regolazione 
che controlla l�intero ciclo. Un ruolo chiave, nella regolazione del 
ciclo cellulare � svolto dalla  fosforilazione e defosforilazione di 
substrati proteici da parte di specifiche chinasi. In particolare, nelle 
cellule eucariotiche somatiche a questo ruolo sono deputate le 
serin/treonin chinasi ciclino-dipendenti o CDK. 
 L�attivit� di queste chinasi � a sua volta soggetta ad una serie di 
complessi meccanismi di controllo. Per essere attive, le CDK, 
richiedono il legame con specifiche subunit� dette cicline. Le cicline 
che intervengono nelle diverse fasi del ciclo cellulare sono espresse 
solo durante lo stadio nel quale devono svolgere la propria funzione. 
La loro classificazione � infatti caratteristica dello stadio del ciclo 
  
 
 
Fig.-1 Schema del ciclo cellulare, ad ogni fase � associato un 
complesso ciclina-CDK. 
  
cellulare in cui vengono espresse: la ciclina D che interagisce con le 
CDK2, CDK4, CDK5, interviene nella fase G
1
; il complesso proteico 
ciclina E/CDK2 modula la transizione G
1
→S; il complesso ciclina 
A/CDK2 si forma nella fase S infine i complessi ciclina B/A-CDK2 
regolano la transizione S→G
2 
(Sherr et al., 1993). La degradazione di 
queste subunit� avviene probabilmente mediante un meccanismo di 
tipo proteolico ubiquitina-dipendente  grazie a delle sequenze 
amminoacidiche (destruction box) contenute nella regione N-
terminale  delle cicline (Morgan., 1995; Glotzer et al., 1991). 
Un secondo evento necessario all�attivazione delle CDK � la 
fosforilazione di uno specifico residuo di treonina  da parte della 
chinasi CDK�attivante o CAK (Fig-2). Il residuo di treonina che viene 
fosforilato dalla chinasi CAK � un residuo piuttosto conservato (Thr 
160/161) e durante il normale ciclo cellulare dei vertebrati  il 
trasferimento di fosfato su questo residuo sembra aumentare 
parallelamente  con la formazione del legame alla ciclina (Krek  et al., 
1992). Comunque il complesso cos� formato � in grado di agire quale 
modulatore positivo del ciclo cellulare. 
L�inattivazione di questi complessi pu� avvenire in diversi modi ad 
esempio tramite l�intervento di una fosfatasi (CDC25) che rimuove il 
fosfato sulla Thr 160/161; questo tipo di meccanismo probabilmente 
agisce sul turn-over del complesso, ne facilita cio� il pathway di 
degradazione. Alternativamente, l�inattivazione del complesso ciclina-
CDK, pu� avvenire per aggiunta di un secondo fosfato, questa volta 
su un residuo di tirosina (Tyr15) presente nella regione N-terminale 
del complesso per azione di una  chinasi denominata Wee1 (Morgan,  
1995). I complessi ciclina-CDK possono infine essere inibiti 
dall�interazione con una seconda classe di proteine: gli inibitori delle 
chinasi ciclino dipendenti (CKI). 
  
Le CKI, appartengono ad una classe di piccole proteine che agiscono 
da regolatori negativi del ciclo cellulare. Esse hanno sollevato, negli 
ultimi anni, un interesse sempre maggiore ai fini della comprensione 
dei meccanismi che regolano la proliferazione cellulare nei 
mammiferi, oltre che per le loro potenziali applicazioni in campo 
biomedico.  
 
 
 
Fig.-2 Schema riassuntivo sulla regolazione dei complessi ciclina-CDK. 
 
 
  
1.2 Inibitori delle CDK: la proteina p27. 
  
Gli inibitori delle chinasi ciclino-dipendenti o CKI formano complessi 
di natura non covalente con i dimeri ciclina�CDK inattivandoli, 
rendendo possibile cos� un controllo negativo della proliferazione 
cellulare. E� intuitivo quindi che  eventi deregolativi a carico di queste 
molecole proteiche possono avere un ruolo importante nella 
cancerogenesi. Le CKI sono  divise in due famiglie in base alle loro 
caratteristiche strutturali ed alla loro specificit� di legame. La prima 
classe di proteine � formata dagli  inibitori di CDK4 o INK4 a questa 
classe appartengono p16
INK4a
 (Serrano et al., 1993) , p15
INK4b
 (Hannon 
and Beach, 1994), p18
INK4c
(Guan et al., 1994) e p19
INK4d
 (Chan et al., 
1995). Tutte si legano in maniera altamente specifica esclusivamente 
alla CDK4 ed alla sua isoforma CDK6 (Sherr et al., 1995). Le proteine 
della famiglia Cip/Kip, invece, legano ed inibiscono esclusivamente i 
complessi ciclina-CDK che intervengono durante le fasi G
1
 ed S. A 
quest�ultima classe di inibitori appartengono: p21
Cip1/WAF1
(Gu et al., 
1993), p27
kip1
(Polyak et al., 1994) e p57
kip2
 (Lee et. al.,1995). Sebbene 
queste proteine siano in grado di legare indipendentemente la CDK e 
la ciclina isolata, esse mostrano un�affinit� molto maggiore per il 
legame con il complesso ciclina-CDK (Nakanishi et al., 1995; Lin et 
al., 1996). Le proteine Cip/Kip sono in grado di inibire le chinasi 
cicline E-, A- e D-dipendenti e come tali giocano un ruolo importante  
nel controllo del ciclo cellulare in risposta a fattori anti-mitogeni (Xu 
et al., 1999). 
p27, dunque, � un inibitore della famiglia Cip/Kip e come tale � un 
regolatore negativo del ciclo cellulare, � una piccola proteina di circa 
23kDa e viene normalmente espressa in quasi tutti i tessuti umani. 
Blocca la progressione dalla fase G
1
 alla fase S legandosi con il 
complesso ciclina/E-CDK2 ed inibendone l�attivit�. Le Cip/Kip sono 
  
altamente conservate. Tra le proteine di questa famiglia, p21 e p27 
mostrano  il pi� alto grado di omologia a livello di sequenza 
primaria.
 
La sequenza amminoacidica riportata in Fig-3, costituisce la regione 
che effettivamente lega il complesso ciclina-CDK. Il legame tra p27 e 
la ciclina avviene attraverso l�interazione tra la regione coil/α -helix  
dell�inibitore ed una sequenza caratteristica della ciclina stessa (ciclin-
box), mentre il legame con la CDK2 avviene attraverso il 
coinvolgimento di una regione pi� estesa di p27 (β-hairpin/β-
strand/3
10
helix) con la regione N-terminale della subunit� catalitica 
della CDK. E� in particolare, attraverso questa seconda interazione, 
che p27 impedirebbe stericamente l�accesso al sito attivo della chinasi, 
rendendolo inattivo (Russo et al., 1996). Entrambi gli inibitori, p21 e 
p27, contengono al C-terminale una sequenza amminoacidica come 
segnale per la localizzazione nucleare o SNL (Polyak et al., 1994). E� 
stato, inoltre, dimostrato che il controllo dell�attivit� in vivo di p27 � 
di tipo post-traduzionale: con la formazione del trimero ciclina/E-
CDK/p27 l�inibitore stesso diviene, attraverso un meccanismo ancora 
 
 
 
 
 
 
 
Fig.-3 Sequenza amminoacidica relativa alla regione N-terminale degli inibitori delle
chinasi cilino-dipendenti p27 e p21. 
  
non del tutto chiarito, substrato della CDK che � ora in grado di 
trasferire un gruppo fosfato sulla treonina 187 di p27. (Montagnoli  et 
al., 1999; Lyuben  et al.; 1999) Anche in questa caso la fosforilazione 
sul residuo amminoacidico � essenziale; infatti, la proteina fosforilata 
viene riconosciuta da un complesso proteico (SCF) che media un 
meccanismo di degradazione ubiquitina-dipendente attraverso la via 
del proteosoma 26S (Pagano et al., 1995). Il turn-over  temporale e 
selettivo di questi inibitori mediante ubiquitina/proteosoma � un 
meccanismo di regolazione molto valido ed ampiamente adottato dalla 
cellula,  anche per altre proteine.  
Non si possono escludere, comunque, per questa classe di inibitori, 
vie di regolazione alternative. E� stato, infatti, recentemente proposto 
per p21, un nuovo meccanismo di regolazione basato sulla ritenzione 
della proteina nel citoplasma. Tale meccanismo impedisce la 
traslocazione di p21 nel nucleo dove fisiologicamente svolge la sua 
normale funzione.  La protein chinasi B o AKT fosforila l�inibitore a 
livello della treonina 145 e la proteina fosforilata non � pi� in grado 
di traslocare nel nucleo (Zhou et al., 2001).  
E� interessante notare inoltre che la maggior parte delle cellule 
tumorali della tiroide conservano un livello di espressione normale di 
p27 (Erickson et al., 1998; Resnick et al.,1998). Quindi nonostante la 
presenza dell�inibitore, si osserva una crescita aberrante delle cellule e 
di conseguenza, un�elevata attivit� delle CDK2. Questo pu� essere 
spiegato, come per p21, dalla ritenzione di p27 nel citoplasma. 
(Yaroslavskiy et al., 1999; Baldassarre et al., 1999). La sequenza SNL,  
quindi in qualche modo non sarebbe pi� in grado di fornire 
l�informazione necessaria per il passaggio, di p27, nel nucleo. Questo 
inibitore quindi, sembra costituire un�importante connessione tra 
mitogeni extra-cellulari e ciclo cellulare, con una correlazione inversa 
tra la sua attivit� e la capacit� di proliferazione cellulare.