Studio delle comunità batteriche del rumine di bovine alimentate con silomais Bt (evento 176)

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�geneticamente modificati� o, pi� semplicemente, �transgenici� [Poli 1997]. I geni 
eterologhi possono appartenere ad un organismo diverso oppure essere costrutti chimerici 
comprendenti parti di geni diversi. L�espressione di tali geni � regolata da promotori 
dell�organismo ospite o da promotori anch�essi eterologhi. 
Quanto detto applicato al regno vegetale porta alla produzione di piante geneticamente 
modificate (PGM). Attualmente il numero di piante geneticamente modificate utilizzate in 
agricoltura supera abbondantemente la dozzina di specie e tra esse non presenziano pi� 
solo le major crops, coltivate estensivamente su tutto il pianeta, ma pure specie che 
crescono solo in determinate regioni del pianeta (mango, banana, papaya�) e legate a 
tradizioni culturali ed a esigenze alimentari non globali. 
 
1.1.2 Applicazioni delle PGM 
Le applicazioni delle biotecnologie in agricoltura sono praticamente limitate solo dalla 
fantasia dei ricercatori e dalle conoscenze nel campo della biologia molecolare e della 
biochimica dei sistemi vegetali.  Escludendo i �prototipi� di piante utilizzabili come vaccini 
in questa sezione viene riportato un breve excursus su quali siano le applicazioni pi� 
comuni delle biotecnologie vegetali. 
 
1.1.2.1 Piante resistenti a parassiti 
Le tecnologie che permettono la resistenza ai parassiti sono essenzialmente di due tipi, 
differenziati in base al parassita: resistenza ad insetti e resistenza a virus (fig. 1.1). La 
prima � raggiunta introducendo geni che codificano per proteine che possiedono attivit� 
insetticida assai specifica per un insetto target. Tale tecnologia � pure utilizzata per la 
protezione contro nematodi parassiti radicali. Questa tecnologia � stata applicata con 
successo su mais, cotone e pioppo e variet� delle prime 
due sono ampiamente coltivate nel mondo. 
La seconda classe di resistenze � ottenuta secondo due 
diverse vie:  
I- La prima sfrutta un fenomeno conosciuto come 
�preimmunit�� e si ottiene introducendo nel 
genoma della pianta proteine del capside virale.  
II- La seconda via consiste nell�introdurre nella 
pianta un RNA antisenso a quello specifico del virus: 
l�RNA antisenso si lega a quello virale, che quindi non viene espresso.  
Figura 1.1 - Effetti del virus del mosaico
della banana (BBrMV) sulle foglie di 
banano 
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I geni in questione sono tipicamente posti a valle di promotori forti e costitutivi in modo tale 
da proteggere in maniera efficace tutta la pianta. Questa tecnologia � stata applicata con 
successo a varie specie di piante da frutto (pomodoro, banana, papaya, mango�) e si 
presenta come una valida strategia di lotta a virosi che provocano gravi danni ai raccolti, 
virosi che non possono essere curate con prodotti fitosanitari analogamente a quanto si fa 
con altri tipi di parassiti. 
 
1.1.2.2 Piante resistenti a fitofarmaci 
La resistenza a fitofarmaci � introdotta per permettere l�utilizzo di erbicidi totali in maniera 
da eliminare tutte le piante sul campo eccetto quelle di interesse. Attualmente tali tecniche 
sono applicate con successo contro quattro erbicidi ad ampio spettro: glifosate, 
glufosinate, bromoxynil e solfoniluree. 
La resistenza � ottenuta in due maniere differenti introducendo l�enzima target del 
fitofarmaco in una forma non sensibile allo stesso fitofarmaco oppure introducendo un 
enzima in grado di detossificare il fitofarmaco. 
Nel primo modo sono costruite le resistenze al glifosate ed alle solfoniluree. Il glifosate 
inibisce l�enzima EPSPS coinvolto nella sintesi di amminoacidi aromatici; l�introduzione di 
un EPSPS alternativo proveniente da Salmonella typhimurium. permette di avere un by-
pass su questa via biosintetica [Comai et al. 1985]. Le solfoniluree, invece, inibiscono 
l�enzima ALS (acetolattato sintasi) e il by-pass si ottiene introducendo una ALS mutante 
[Haughn et al. 1988] proveniente da tabacco. 
Diverso � il caso del glufosinate e del bromoxynil. Il glufosinate (o meglio il suo principio 
attivo, fosfinotricina) nelle piante resistenti � reso inattivo con l�introduzione di un enzima 
(fosfinotricina aciltransferasi, PAT) che � in grado di utilizzare il gruppo acetico del CoA e 
trasferirlo alla fosfinotricina (acetil-fosfinotricina) rendendola inattiva [DeBlock et al. 1988]. 
Nel caso del bromoxynil, in grado di bloccare la fotosintesi, la resistenza si ottiene 
introducendo un enzima proveniente da Klebsiella pneumoniae che opera una 
denitrilazione del principio trasformandolo nell�acido 3,5-dibromo-4-idrossibenzoico, 
innocuo per la pianta. 
Queste tecnologie sono state introdotte con successo in piante coltivante in maniera 
intensiva come mais e soja. 
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1.1.2.3 Piante con tenore nutrizionale migliorato 
In questo settore sono stati compiuti vari sforzi dal momento che rappresenta una 
importante scommessa per le agro-biotecnologie del prossimo futuro. Tralasciando i 
tentativi fallimentari di cambiare il quadro amminoacidico in soja o in mais, al momento 
sono tre gli esempi pi� clamorosi in questo settore di applicazione. Il primo di essi � il 
cosiddetto �Golden rice�, riso dal tipico colore giallo della 
cariosside (fig. 1.2). Il colore deriva dalla produzione di 
carotenoidi in un tessuto non fotosintetico come 
l�endosperma; la biosintesi � possibile grazie all�introduzione 
della fitoene sintasi (da narciso) che catalizza la 
dimerizzazione di due molecole di geranilgeranil pirofosfato a 
dare fitoene [Burkhardt et al. 1997, Ye et al. 2000]. Questa 
modificazione � stata fatta con l�intento di coadiuvare le cure 
di deficienza di vitamina A in popolazioni la cui dieta � poco 
diversificata e principalmente basata su riso (Cina, India e 
sud-est asiatico in particolare), notoriamente povero in 
vitamina A o suoi precursori .  
Un altro esempio a riguardo � una variet� di riso in cui � aumentato l�accumulo di ferro; 
questo � reso possibile dall�introduzione del gene della ferritina di Phaseolus vulgaris. I 
livelli di ferro aumentano di due volte rispetto al wild-type e la sua biodisponibilit� � resa 
possibile grazie all�introduzione di un gene per una fitasi termotollerante di Aspergillus 
fumigatus, in grado di ridurre la quantit� di acido fitico che inibisce l�assorbimento di ferro, 
e di uno per una proteina ricca in cisteina simile alle metallotioneine endogene: la cisteina 
contribuisce all�assorbimento del ferro durante la digestione [Lucca et al. 2000]. 
Un ultimo esempio � dato da una variet� di orzo in cui sono stati introdotti dei geni per 
delle glucanasi e delle xylanasi batteriche che permettono la degradazione delle pareti 
cellulari che altrimenti interferirebbero con la digestione da parte dell�animale. Proprio a 
questo scopo tali enzimi sono aggiunti alla razione alimentare negli allevamenti. 
 
1.1.2.4 Piante a maturazione controllata 
Varie piante da frutta sono state modificate in questo senso per permettere un ritardo della 
maturazione in modo da poter ritardare la maturazione sulla pianta o per aumentare la 
conservabilit� del prodotto in vendita. I meccanismi per ritardare la maturazione si basano 
comunque sull�introduzione di geni in antisenso che impediscono la sintesi di taluni fattori 
Figura 1.2 - Edizione asiatica 
del Time in cui il Golden rice è 
storia di copertina 
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nel metabolismo dell�etilene. Cos� vi sono prodotti in cui la sintesi dell�etilene � inibita con il 
silenziamento dei geni deputati alla sua sintesi (ACC sintasi o ACC ossidasi). Vi sono pure 
prodotti in cui � inibito il recettore dell�etilene e, conseguentemente, la cascata di eventi a 
valle dello stesso. In alternativa vengono inibiti enzimi attivati indirettamente dall�etilene e 
responsabili della degradazione della parete cellulare, come, ad esempio, la 
poligalatturonidasi che degrada la parete cellulare (come nel caso del pomodoro Flavr 
Savr�). 
 
1.1.2.5 Piante per la produzione di composti utili all�industria 
In questa categoria rientrano alcune variet� di colza in cui la composizione in acidi grassi � 
stata modificata per favorire l�accumulo di acido stearico o di acido laurico e una variet� di 
soja ad alto contenuto di acido oleico. Le oleaginose sono oggetto di continui studi anche 
per l�accumulo di acidi organici altrimenti reperibili solo dalla raffinazione del petrolio 
[Ohlrogge 1994]. Studi pionieristici sono stati anche indirizzati alla produzione di polimeri 
plastici biodegradabili (poliidrossialcanoati, in particolare poliidrossibutirrato) alternativi al 
polietilene [Poirier et al. 1992, Nawrath et al. 1994] anche se la effettiva vantaggiosit� di 
queste modificazioni � messa in dubbio dato l�alto costo di tali produzioni. 
 
1.1.3 Diffusione delle PGM 
Secondo l�ISAAA (International Service for the Acquisition of Agri-biotech Applications) 
l�area totale di coltivazioni transgeniche nel mondo � stimabile intorno ai 50 milioni di ettari 
alla fine del 2001 [ISAAA 2001]. Questo dato indica che la crescita annua di tale superficie 
� aumentata del 10% rispetto al 2000. Nonostante il continuo dibattito sulle coltivazioni 
GM, particolarmente nei paesi dell�Unione Europea, milioni di grandi e piccole aziende 
agricole continuano ad aumentare le loro piantagioni di colture GM, sia nei paesi 
industrializzati che in quelli in via di sviluppo. 
Dal 1996, anno in cui le prime piante transgeniche ad uso commerciale furono piantate in 
pieno campo, la superficie coltivata con tali piante � cresciuta di 30 volte e oggi sono pi� 
15 le nazioni in cui sono coltivate estesamente PGM, tra cui Argentina, Australia, Canada, 
Cina, USA e Sud Africa. Queste nazioni hanno coltivato negli ultimi sei anni una superficie 
cumulativa di 175 milioni di ettari a piantagioni transgeniche [ISAAA 2001]. 
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1.1.4 Problematiche ambientali 
L�utilizzo di PGM e l�introduzione delle stesse in ambienti esterni ai laboratori le mette in 
relazione con una serie di fattori biotici ed abiotici. Come le PGM interagiscano con tali 
fattori � continuamente oggetto di studi principalmente per valutare le condizioni 
agronomiche ottimali per la loro coltivazione. Dal momento che per� non � possibile 
prevedere gli effetti che coltivazioni GM hanno sull�ambiente si � dovuto ammettere, in via 
precauzionale, l�esistenza di alcuni rischi potenziali. 
 
1.1.4.1 Diffusione di transgeni nell�ambiente e trasferimento genico orizzontale 
 Un rischio derivante dall�introduzione di un ecosistema di DNA eterologo � la possibilit� 
che questo venga acquisito ed integrato in altri organismi presenti nello stesso 
ecosistema. Questo meccanismo, chiamato scambio genico orizzontale (HGT) � assai ben 
caratterizzato e dimostrato nei batteri per i quali rappresenta un importante meccanismo 
evolutivo [Lorenz et al. 1994]. Per i batteri lo scambio genico orizzontale pu� avvenire per 
diverse vie: batteri con capacit� coniugative possono trasferire a batteri riceventi una 
grande quantit� di sequenze; gli elementi necessari alla coniugazione possono trovarsi su 
plasmidi o su trasposoni ed essere eventualmente integrati nel genoma. In questo caso, 
durante la coniugazione, vengono trasferite anche sequenze cromosomiche. 
Il processo di trasduzione incompleta, mediato da batteriofagi, prevede che un fago il cui 
genoma si sia integrato nel batterio infettato possa incorporare nel suo cromosoma anche 
DNA batterico al momento della sua attivazione. In una successiva infezione tale DNA pu� 
trasferirsi in maniera stabile ad un altro batterio. 
I batteri sono in grado, attraverso il processo di trasformazione, di incorporare DNA libero 
nell�ambiente. Un processo di ricombinazione omologa segue e il DNA esogeno � 
stabilmente introdotto e replicato all�interno del corredo genetico del batterio.  
Il trasferimento orizzontale � per� dimostrato avvenire anche tra organismi appartenenti a 
differenti regni. In particolare Schubbert et al. [1997] hanno mostrato come DNA del fago 
M13mp18 addizionato alla dieta di topi pu� essere rinvenuto, tramite PCR e ibridazione in 
situ, all�interno dei leucociti, nella milza e nel rene. Estraendo dalla milza il DNA e 
clonandolo in una libreria di fagi λ,  si � caratterizzato un clone in cui era presente un 
frammento di 1299 bp appartenente al fago M13mp18. Tale frammento era legato ad una 
sequenza di 80 bp omologa per il 70% con il gene del recettore IgE del topo. 
A conclusioni simili si � pervenuto per l�HGT tra piante e virus [Greene e Allison 1994] e 
tra piante e batteri [Ghebard e Smalla 1998, deVries e Wackernagel 1998, Nielsen et al. 
 10 
2000]. In questi lavori � stato messo in evidenza come geni eterologhi con alta omologia 
con geni degli organismi riceventi possano passare a questi ultimi ed essere incorporati 
stabilmente nel genoma. 
In campo non si pu� escludere la presenza di DNA vegetale libero nel terreno dal 
momento che la crescita delle radici comporta lo sfaldamento dell�apice radicale e la 
liberazione nella rizosfera del contenuto delle cellule vegetali. I batteri della rizosfera si 
trovano a stretto contatto sia con sostanze nutritive che con DNA della pianta. Inoltre, nel 
caso del mais, la coltivazione prevede che gli stocchi permangano nel terreno anche dopo 
la mietitura aumentando cos� le probabilit� di liberare DNA nel terreno conseguentemente 
alla lisi cellulare. 
Nell�apparato digerente degli animali, e in particolare nel rumine, il numero e la variet� di 
specie batteriche sono assai elevati (par. 1.3.2.3) e tali batteri sono a stretto contatto con 
l�alimento. 
Molti lavori hanno dimostrato il trasferimento di plasmidi e trasposoni coniugativi attraverso 
la coniugazione in vitro tra batteri del rumine. Lo scambio genico � stato dimostrato in 
condizioni naturali facendo ingerire i batteri donatori con il cibo ed analizzando la presenza 
di batteri trasformanti nelle feci in ratti ed insetti. Inoltre lo studio di omologie di sequenza 
di particolari geni posizionati su trasposoni coniugativi, che codificano per la resistenza ad 
antibiotici, suggeriscono eventi di HGT tra organismi diversi non strettamente correlati. 
Nell�ambiente gastrico il tempo di residenza di DNA libero � assai breve, nel liquido 
ruminale viene degradato in 10 minuti [Morrison 1996]. Per questo motivo si suppone che 
il trasferimento genico all�interno del tratto digerente sia da imputare a trasferimento di 
plasmidi e trasposoni coniugativi o a trasduzione mediata da batteriofagi, piuttosto che 
uptake di DNA libero. Tuttavia si � dimostrato come batteri naturalmente competenti 
possano introdurre DNA libero a velocit� piuttosto elevate, in questo senso anche un 
tempo cos� limitato potrebbe essere sufficiente alla trasformazione. In pi� il DNA libero 
potrebbe rimanere retrogradato da polimeri vegetali non ancora digeriti per un tempo 
sufficiente a questo processo. 
Recenti lavori hanno poi dimostrato che in presenza di sola saliva umana Streptococcus 
gordonii pu� essere competente ed in grado di incorporare DNA fino a 9 minuti dopo 
l�introduzione di questo [Mercer et al. 1999]. Considerato che la microflora ruminale � 
continuamente alimentata da microrganismi provenienti dall�ingestione di materiale non 
pu� essere escluso che batteri trasformanti possano raggiungere il rumine e qui trasferire 
DNA eterologo attraverso meccanismi descritti per l�HGT tra batteri.  
 11 
Studi in vivo risultano piuttosto difficili da effettuare ma � dimostrato che Streptococcus 
bovis JB1 � competente in fase stazionaria di crescita in presenza di liquido ruminale in 
vitro [Mercer et al. 1999]. 
  
1.1.4.2 Impatto sulla biodiversit� 
Uno secondo rischio paventato derivante dall�utilizzo di piante geneticamente modificate in 
agricoltura ed in alimentazione � quello di alterazioni della biodiversit� ambientale. 
Nel corso della sua esistenza la pianta interagisce con un elevato numero di specie viventi 
appartenenti a tutti i regni conosciuti. L�introduzione di una nuova capacit� metabolica in 
una pianta comporta quindi una perturbazione degli ambienti circostanti, dal campo 
coltivato all�apparato digerente degli animali che si nutrono della pianta,diversa da quella 
determinata dall�impiego di piante tradizionali. Tale perturbazione pu� comunque essere 
ininfluente se di piccola entit� o se l�ecosistema � in grado di reagire alla variazione senza 
discostarsi dalla precedente situazione di equilibrio. 
Nel caso in cui siano state introdotte capacit� insetticide, come nel caso della tecnologia 
Bt, il rischio �, in primo luogo, l�azione della nuova tossina contro insetti non-target. Losey 
et al. [1999] hanno dimostrato che il mais Bt pu� danneggiare le larve della farfalla 
monarca (Danaus plexippus) oltre a quelle della piralide (Ostrinia nubilalis), contro le quali 
� stato progettato, sebbene le condizioni verificate in laboratorio si discostino parecchio da 
quelle realmente presenti in campo.  In un successivo lavoro [Stanley-Horn et al. 2001] la 
tossicit� di tre differenti mais Bt � stata valutata con studi in campo dimostrando che il 
mais Bt evento 176 � l�unico il cui polline dimostri una certa tossicit�, mentre il polline dei 
mais Bt11 e Mon810 non si comporta diversamente da mais non-Bt. Per questo la 
mortalit� delle larve di D. plexippus all�interno di campi coltivati a mais Bt evento 176 � 
maggiore che all�esterno di essi. In altri studi � stata verificata la tossicit� che larve di 
piralide che hanno ingerito mais Bt hanno su adulti di predatori come il  neurottero 
Chrisoperla carnea che anche di tali larve si nutrono [Hilbeck et al. 1998]. Nonostante in 
natura gli adulti di C. perla attacchino le larve di piralide prima che queste inizino a nutrirsi, 
cio� quando le larve di piralide non sono ancora penetrate nella pianta e abbiano assunto 
la tossina, questi esperimenti suggeriscono la possibilit� che esistano catene trofiche non 
eventualmente verificate o addirittura sconosciute che potrebbero essere perturbate 
dall�introduzione di una tossina altrimenti presente solo nel suolo. 
L�utilizzo di PGM potrebbe avere effetti pure sulla biodiversit� di piante coltivate e piante 
selvatiche. Gi� la diffusione delle monocolture in agricoltura ha ridotto considerevolmente 
 12 
il numero di variet� coltivate negli ultimi 50 anni; il numero delle cultivar di piante utilizzate 
per la produzione di linee transgeniche � poi minore di quello delle cultivar oggi coltivate. 
In questo senso l�introduzione di PGM in agricoltura potrebbe ridurre ulteriormente il 
numero di variet� utilizzate con il rischio di perdere estesi raccolti nel caso la variet� 
utilizzata si dimostrasse inefficiente ad affrontare una avversit� non prevista e che si 
dovesse presentare. 
 Il rischio che il polline di PGM si diffonda nell�ambiente in maniera incontrollata e che 
possa fecondare piante filogeneticamente simili comporterebbe la diffusione in ambienti 
selvatici di piante con caratteristiche nuove [Arriola e Ellstrand 1997]. In particolare si 
ipotizza che l�acquisizione di nuove capacit� di resistenza (per esempio ad un parassita) 
possa aumentare la fitness della pianta ricevente che si troverebbe avvantaggiata nel 
proprio ecosistema, potendosi eventualmente diffondere a scapito di altre specie. Tuttavia 
questo rischio � ancora in discussione dal momento che per verificarsi si deve avere 
fioritura contemporanea della pianta donatrice e di quella ricevente, le due devono 
condividere lo stesso impollinatore (nel caso di impollinazione entomofila) o devono 
essere sufficientemente vicine per permettere il trasporto di polline vitale (nel caso di 
impollinazione anemofila) [Schleffer e Dale, 1999]. L�efficienza dei transgeni dipender� poi 
dalla fertilit� della progenie dell�ibrido, dalla forza e fertilit� delle generazione seguenti oltre 
che dalla pressione selettiva dei transgeni dell�ospite [Stewart et al. 1997]. 
Dove c�� intimo contatto tra microrganismi e materiale vegetale si pu� supporre che 
possano avvenire modificazioni nella microflora e microfauna. In questo senso l�ambiente 
pi� studiato � la rizosfera delle piante dal momento che l�alterazione delle comunit� di 
organismi nel suolo potrebbe avere numerose implicazioni sulla fertilit� e di conseguenza 
sulla chiusura delle catene trofiche. La composizione delle microflora risulta direttamente 
dipendente, oltre che da fattori ambientali, anche dalla specie o addirittura dalla variet� di 
pianta colonizzata [Grayston et al. 1998]. 
Oger et al. [1997] hanno dimostrato una modificazione nella diversit� di batteri associati 
alla radice in piante geneticamente modificate per la produzione negli essudati radicali di 
opine, modificazione finalizzata ad arricchire la rizosfera di batteri promotori della crescita 
radicale (PGP, Plant Growing Promoting) capaci di utilizzare le opine come fonte di 
carbonio. In questo caso il numero di opine-degradanti era significativamente differente tra 
la rizosfera delle piante transgeniche e quelle controllo. Siciliano e Germida [1999] hanno 
caratterizzato circa 2300 isolati da rizosfera e da rizoplano di piante di colza di variet� 
normali e tolleranti gli erbicidi: i risultati hanno dimostrato che la composizione delle 
 13 
comunit� microbiche associate alle radici � diversa per cultivar di colza GM e colza 
normale e che l�influenza della cultivar sulla diversit� dei microrganismi era pi� 
pronunciata all�interno delle radici (rizoplano), piuttosto che all�esterno (rizosfera). 
Donegan et al. [1996] hanno valutato la carica totale batterica, la carica totale e la diversit� 
della popolazione fungina, ed alcuni fitopatogeni, in campioni di foglie e rizosfera di patate 
Bt e normali rilasciate in un campo sperimentale. Da questo studio non sono state rilevate 
differenze nella colonizzazione microbica dei campioni transgenici o normali. Gli stessi 
autori hanno successivamente studiato per un periodo di 5 mesi la decomposizione di 
foglie di tabacco GM e normale interrate nel suolo. Sono stati confrontati gli effetti sulle 
popolazioni di microartropodi, nematodi e protozoi, ed inoltre sono state valutate le 
differenze qualitative e quantitative della microflora con un�analisi indiretta tramite 
misurazione del metabolismo microbico indotto dall�aggiunta di glucosio ai campioni di 
suolo. Il risultato del lavoro ha dimostrato che in condizioni di campo la proteina insetticida 
rimane attiva per almeno 57 giorni e che il processo di decomposizione varia a seconda 
del tipo di materiale vegetale ed in risposta all�esposizione a organismi del suolo. Infatti i 
campioni provenienti dalla decomposizione del tabacco transgenico contenevano un 
inferiore contenuto di carbonio ed un numero superiore di microartropodi (Collembola) e 
nematodi. Per quanto riguarda le comunit� di batteri, protozoi ed insetti, non sono state 
verificate differenze significative. 
Un altro ambiente naturale dove microrganismi sono a stretto contatto con materiale 
vegetale � l�apparato digerente animale. I batteri qui hanno azione degradante su alcuni 
componenti della dieta e si trovano in alta carica nell�intestino di tutte le specie animali. Nel 
rumini di bovini ed ovini, inoltre, una ricca microflora composta di batteri, funghi, archea e 
protozoi, svolge la funzione di digestione del materiale vegetale. 
Pochi sono finora gli studi sulle differenze della microflora dell�apparato digerente in vivo in 
seguito ad alimentazione composta da piante transgeniche. Numerosi autori hanno 
caratterizzato la microflora intestinale di molte specie diversi: insetti [Thimm et al. 1998], 
polli [Apajalahti et al. 1998], bovini [Hobson 1997]. Masoero et al. [1999] hanno valutato la 
digeribilit� del mais in microcosmi costituiti da rumine artificiale, senza evidenziare 
differenze significative tra mais Bt e mais normale. In un recente lavoro [Borin et al. 2000b] 
si � cercato di valutare le differenze nella microflora del rumine in bovine alimentate con 
granella di mais Bt e controllo senza per� trovare differenze significative. 
 14 
1.2 Mais Bt 
Il mais Bt � autoprotetto contro gli attacchi del lepidottero Ostrinia nubilalis grazie 
all�introduzione di una tossina proveniente da Bacillus thuringiensis kurstaki (da cui il nome 
Bt).  
 
1.2.1 Le tossine Cry 
Le tossine Cry sono proteine ad attivit� insetticida prodotte da Bacillus thuringiensis. Esse, 
insieme alle proteine Cyt, formano il gruppo delle δ -endotossine che comprende numerose 
varianti geniche di tali proteine. Sono note pi� di 130 varianti del gene cry la cui 
classificazione � stata fatta in base all�insetto target, per cui si sono distinti quattro gruppi 
di tossine Cry: 
I) specifiche per i lepidotteri 
II) specifiche per lepidotteri e ditteri 
III) specifiche per i coleotteri 
IV) specifiche per i ditteri 
Recentemente la suddivisione � stata riformulata in base alle relazioni filogenetiche tra le 
varianti conosciute [Crickmore et al. 1998]. 
Diverse sottospecie di B. thuringiensis producono un differente set di tossine Cry, in grado 
di agire sinergicamente tra loro ed eventualmente aumentando lo spettro di tossicit� per 
una determinata sottospecie.   
Le tossine Cry vengono prodotte come 
protossine in fase stazionaria di 
crescita, in concomitanza con la 
sporulazione, e vengono incluse in un 
cristallo proteico parasporale di notevoli 
dimensioni. 
La struttura tridimensionale delle tossine 
attive evidenzia la presenza di 3 domini 
(fig. 1.3): il primo, composto da 7 α -
eliche di cui una � circondata da un 
fascio concentrico formato dalle 
rimanenti 6 eliche; questo dominio � 
responsabile dell�attivit� tossica della 
Figura 1.3 - Struttura tridimensionale della δ− endotossina 
cry3A 
 15 
proteina. Il secondo dominio, costituito da tre foglietti β  antiparalleli disposti intorno ad un 
centro idrofobico, � responsabile della specificit� della tossina riconoscendo uno specifico 
recettore nel lume intestinale dell�insetto. Il terzo dominio, costituito da 2 foglietti β,  � 
probabilmente responsabile delle modificazioni strutturali che permettono di espletare 
l�azione tossica in seguito al legame con il recettore e anche della protezione della tossina 
da proteasi presenti nell�intestino dell�insetto.  
Sebbene alla famiglia delle tossine Cry appartengano proteine anche eterogenee nella 
sequenza, la struttura tridimensionale e l�organizzazione dei domini � molto conservata, di 
conseguenza si pu� supporre un meccanismo di azione comune a tutta la famiglia. 
L�azione tossica si esplica con una proteolisi a pH basico dei domini N- e C- terminali che 
libera la tossina attiva. Questa si lega ad uno specifico recettore sulla membrana 
peritrofica nel lume intestinale. Tre putativi recettori per tre diverse tossine Cry sono 
aminopeptidasi N, metalloproteasi con centri a zinco presenti in tutti gli animali, e 
dimostrano avere una sequenza consenso RLPTTTRPRHY, carica positivamente e molto 
polare, possibilmente implicata nel riconoscimento della tossina. Una volta avvenuto il 
legame la tossina Cry subisce una modificazione conformazionale e le α -eliche del primo 
dominio creano un poro di 10-20 � che permette un massiccio ingresso di ioni K
+
 ed 
efflusso di ioni H
+
 nelle cellule colonnari dell�epitelio intestinale. Lo sconvolgimento 
dell�osmosi delle cellule ne provoca la lisi e l�impossibilit� per l�insetto di assorbire nutrienti. 
La larva smette quindi di alimentarsi e muore in breve tempo. 
I geni cry presentano 5 blocchi di omologia di sequenza importanti per la funzionalit� della 
tossina codificata. 
I geni pi� studiati ed impiegati nella creazione di piante transgeniche sono quelli della 
classe cryI in cui sono state raccolte 20 sequenze con pi� del 50% di omologia, suddivise 
in 6 sottoclassi da cryIA a cryID. 
 
1.2.2 L�evento 176 Novartis 
Nell�evento 176 Novartis � stato introdotto il gene cryIA(b) per proteggere la pianta dalla 
piralide. La sequenza del gene � stata opportunamente modificata per permettere il 
corretto codon usage in mais. Il gene sintetico codifica esclusivamente per la forma attiva 
della tossina (648 aa in confronto ai 1155 aa della protossina). Nella regione 3� non 
tradotta del gene � stato inserito l�introne n� 9 della fosfoenolpiruvato carbossilasi di mais: 
l�introduzione di un piccolo introne a valle incrementa e stimola l�espressione di geni 
eterologhi [Koziel et al.1993]. 
 16 
L�evento 176, ottenuto con il metodo biolistico, contiene 2 copie del gene cryIA(b) sintetico 
uno sotto il controllo del promotore del gene della fosfoenolpiruvato carbossilasi (PEPC) di 
mais, e l�altro sotto il promotore del gene della chinasi calcio-dipendente di mais, 
promotore specifico per l�espressione nel polline. 
L�evento 176 contiene pure il gene bar di Streptomyces hygroscopicus, che conferisce alla 
pianta resistenza al glufosinate, sotto il promotore costitutivo 35S del virus del mosaico del 
cavolfiore (CaMV); tale resistenza � utilizzata come marcatore selettivo per verificare che 
l�evento di trasformazione sia avvenuto. I geni cry e relativi promotori sono inseriti nel 
plasmide pCIB4431 mentre il gene bar � inserito sul plasmide pCIB3064. Entrambi questi 
plasmidi provengono da pUC18 di E. coli che presenta il gene bla per la resistenza 
all�ampicillina utilizzata come marker selettivo durante la costruzione del plasmide. Il gene 
bla, pertanto, permane all�interno del mais cos� ottenuto senza essere espresso poich� � a 
valle di un promotore batterico [Koziel et al. 1993, Novartis Seeds 1996]. 
Le proteine eterologhe sono sintetizzate ad alti livelli unicamente nelle foglie e nel polline, 
il promotore della PEPC non � attivo nelle radici e nel seme. I livelli di espressione della 
proteina sintetica nelle foglie, rilevata tramite test ELISA sono di 1-4� delle proteine 
solubili totali, rispettivamente a 7 settimane di crescita o nelle piante adulte. Nei semi e 
nelle radici il livello di espressione � assai basso risultando la quantit� di proteina 
rispettivamente <5 ppb e <8 ppb calcolata sul peso fresco [Koziel et al. 1993, Novartis 
Seeds 1996]. 
 
1.2.3 Problematiche dovute alla diffusione nell�ambiente di mais Bt 
1.2.3.1 HGT e il gene bla 
Il gene bla � presente all�interno dell�evento 176 come residuo della costruzione dei 
plasmidi per la trasformazione delle piante. Pur non essendo trascritto tale gene porta a 
delle preoccupazioni dovute al fatto che pu� essere trasferito a microrganismi 
nell�ambiente conferendo loro la resistenza agli antibiotici β -lattamici. Tuttavia la capacit� 
di degradazione di questo antibiotico � assai diffusa in natura e il gene bla � condiviso da 
un gran numero di gruppi di batteri: non � possibile, per esempio, discriminare suoli 
coltivati a mais Bt da suoli coltivati a mais isogenico sulla base della conta totale dei batteri 
resistenti all�ampicillina [Borin et al. 2000a]. Questo significa che l�eventuale trasferimento 
di tale gene ai batteri del suolo probabilmente non avrebbe alcun effetto sulle capacit� 
metaboliche delle comunit� ivi presenti.  
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In campo sanitario il problema non � molto differente se si pensa che oggigiorno gli 
antibiotici β -lattamici non sono praticamente pi� efficaci nella cura dei patogeni umani, ad 
indicare come la loro resistenza sia ormai ampiamente diffusa. 
In ogni caso non si deve dimenticare che le omologie di sequenza possono servire anche 
come siti ricombinogeni per altro DNA. 
Nuove variet� di mais Bt sono state progettate  in modo da non contenere marcatori 
selettivi per antibiotici batterici, in maniera tale da escludere totalmente il trasferimento del 
gene bla. 
 
1.2.3.2 Rilascio di proteine esogene negli essudati radicali 
I rischi derivanti dall�utilizzo di piante geneticamente modificate possono non essere 
preventivati durante lo sviluppo della pianta in laboratorio dato l�alto numero di variabili da 
considerare una volta che la pianta viene posta in un ecosistema complesso.  
In un lavoro di Saxena et al. [1999] � stato dimostrato che semi di mais Bt sterilizzati in 
superficie e fatti germinare in terreno agarizzato asettico presentavano discrete quantit� 
della proteina CryIA(b) nel medium di coltura. Tale essudato proteico si � dimostrato 
biologicamente attivo contro larve di Manduca sexta. Una volta che il medium di coltura 
aveva perso la sterilit� non era possibile ritrovare CryIA(b) ma solo i prodotti della sua 
degradazione proteica. 
Medesimi studi su terreno sterilizzato e non, hanno dimostrato che negli essudati radicali 
si poteva ancora trovare una minima quantit� di tossina attiva. In un terreno non sterile si 
pu� comunque supporre che la tossina proteica sia retrogradata dalla degradazione 
attraverso l�adsorbimento ai colloidi presenti. 
L�espressione della proteina Bt in mais non dovrebbe avvenire nelle radici e probabilmente 
le proteine ritrovate negli essudati derivano direttamente dalle foglie, dalle quali giungono 
attraverso il sistema floematico assieme ai fotosintati.  
In un altro lavoro Saxena e Stotzky [2000] hanno indagato il rilascio di tossina nel suolo di 
piante coltivate in percentuali crescenti di caolinite o montmorillonite dimostrando che la 
tossina Bt viene rilasciata durante i 40 giorni di crescita e non viene degradata nel suolo 
probabilmente a causa dell�adsorbimento nei collodi del terreno, mentre non si rilevava 
alcuna tossina nel terreno in cui erano coltivate variet� di mais isogenico non-Bt. 
Sebbene non siano stati indagati gli effetti che la tossina Bt, libera nel terreno, possa 
avere sulle comunit� del suolo, questo esperimenti mettono in evidenza la possibilit� di 
avere degli effetti non previsti o prevedibili durante la costruzione delle PGM.