Pirimidina 5' nucleotidasi da eritrocita umano: clonaggio ed espressione del cdna

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ricombinante e abbiamo controllato se poteva essere quella di nostro 
interesse. 
I risultati sono stati conformi all’attesa: infatti abbiamo clonato ed  
espresso il gene della PN1. 
Riteniamo che questi risultati possano essere di notevole interesse sia 
per una conoscenza più approfondita della proteina, ma anche, dal 
momento che la sua carenza determina una patologia genetica, per 
l’individuazione di mutazioni del gene che possono essere responsabili del 
fenotipo patologico. 
 
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INTRODUZIONE 
 
 
 
Gli studi sulle nucleotidasi pirimidiniche sono iniziate nei primi anni 
70. Dapprima si pensava che esistesse un’unica PN che è stata isolata e 
parzialmente purificata da Torrance e altri nel 1977. La deficienza di 
questo enzima, chiamato fino ad allora pirimidina 5’-nucleotidasi (PN), è 
associata ad un’anemia emolitica non sferocitica ereditaria con modalità di 
trasmissione di tipo autosomico recessivo. La patologia è caratterizzata da 
anisocitosi, reticulocitosi, punteggiatura basofila degli eritrociti, aumento 
del livello di bilirubina, perdita di ferro nelle urine e un accumulo di  
nucleotidi pirimidinici all’interno del globulo rosso. (Torrance et al., 
1977a, 1977b, 1977c).  
Successivamente è stato dimostrato (Swallow et al., 1983; Paglia et al., 
1983,1984) che i pazienti affetti, nonostante fossero difettivi negli eritrociti 
per l’attività PN verso UMP, CMP e dCMP, conservavano una normale 
attività verso dUMP e dTMP. Ciò portò alla scoperta di due distinte attività 
pirimidino nucleotidasiche che furono parzialmente separate da Hirono e 
altri (1985, 1987) e indicate come PN di tipo 1 e PN di tipo 2. 
Le attività delle due PN mostrano una differente termostabilità e 
diverse proprietà enzimatiche e molecolari. I due enzimi vengono codificati 
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da due geni distinti (Hirono et al., 1985) che mappano su due cromosomi 
diversi, ancora sconosciuti. 
La pirimidina 5’-nucleotidasi (PN1), che viene presa in esame in 
questa tesi, è un enzima che catalizza la rimozione del gruppo fosfato dai 
mononucleotidi pirimidinici. Questa proteina svolge un ruolo molto 
importante nella via di recupero dei nucleotidi. Il suo ruolo fisiologico è 
probabilmente quello di regolare la concentrazione intracellulare dei 
nucleotidi pirimidinici e di permettere quindi il trasporto dei nucleotidi, che 
si sono formati a seguito della reazione di defosforilazione, attraverso la 
membrana dell’eritrocita. I nucleosidi rilasciati servirebbero per la 
proliferazione delle cellule eritroidi durante i primi stadi del  loro 
differenziamento.  
Presso il laboratorio del professore Magni la proteina è stata 
purificata fino ad omogeneità e, più recentemente, è stata determinata la 
sequenza aminoacidica della maggior parte di essa. Da tali informazioni 
prende avvio il lavoro che è alla base di questa tesi e cioè il clonaggio e 
quindi l’espressione del gene della PN1. 
Abbiamo ritenuto che questo potesse essere di strumentale 
importanza ad una conoscenza più approfondita della proteina, ma anche, 
dal momento che la sua carenza determina una patologia genetica, 
alll’individuazione di mutazioni del gene che possono essere responsabili 
del fenotipo patologico. 
 9
 
1.1 Pirimidine nucleotidasi 
1.1.1 Le nucleotidasi 
Gli enzimi che catalizzano l’idrolisi dei nucleotidi monofosfato sono 
largamente distribuiti in tutti gli organismi. La competenza fisiologica delle 
nucleotidasi è presumibilmente quella di regolare la concentrazione di 
nucleotidi intracellulari o il trasporto di membrana dei nucleotidi in 
collaborazione con una nucleoside chinasi (Pesi et al., 1994).  
Nelle cellule di mammifero sono stati trovati diversi generi di 
nucleotidasi solubili che sono state classificate in quattro gruppi; 
nucleotidasi con elevata Km (Spychala et al., 1988) che catalizzano in 
maniera preferenziale i nucleotidi purinici; nucleotidasi con bassa Km  
(Madrid-Marina e Fox, 1988); 5’(3’)- nucleotidasi (Fritzon e Smith, 1971) 
che idrolizzano i nucleotidi pirimidinici e in ultimo le pirimidine 5’- 
nucleotidasi (PN). Le PN si trovano negli eritrociti ed includono due 
sottoclassi: PN1 e PN2 (Hirono et al., 1985). 
  
 10
 
1.1.2 Caratteristiche enzimatiche e molecolari delle PN 
Due nucleotidasi pirimidino specifiche (PN1; PN2) sono state isolate 
nella frazione solubile degli eritrociti umani. Gli studi sulla specificità del 
substrato, indicano che la PN1 è maggiormente coinvolta nella 
degradazione  ed eliminazione delle pirimidine 5’-monofosfato negli 
eritrociti, mentre la PN2 idrolizza preferenzialmente le pirimidine 3’-
monofosfato, con l’esclusione dei monofosfati delle citidine e delle 
adenosine (Amici et al., 1991, 1994) (Vedi tabella 1.1). 
 
Tabella 1.1 Specificità della PN1 e della PN2 
Substrat
o 
(1mM) 
PN 1 
Attività 
% 
PN 2 
Attività 
% 
Substrat
o 
(1mM) 
PN 1 
Attività 
% 
PN 2 
Attività 
% 
UMP 100 2 U3’MP 2 64 
CMP 95 0 C3’MP 0 0 
GMP 0 0 G3’MP 0 30 
AMP 0 0 A3’MP 0 0 
IMP 4 2  
   
dUMP 14 13 dU3’MP 3 72 
dCMP 52 0 dC3’MP 0 0 
dTMP 43 7 dT3’MP 0 100 
dGMP 0 0 dG3’MP 0 4 
dAMP 0 0 dA3’MP 0 0 
dIMP 0 20  
   
cU2’3’MP 0 0 cU3’5’MP 0 0 
cC2’3’MP 0 0 cC3’5’MP 0 0 
cG2’3’MP 0 0 cG3’5’MP 0 0 
cA2’3’MP 0 0 cA3’5’MP 0 0 
  cT3’5’MP 0 0 
   
U2’MP 4 36 G2’MP 0 1 
C2’MP 3 0 A2’MP 0 0 
 
 11
 
 
Il peso molecolare della PN1 è di 34.000 daltons, sia in SDS-PAGE 
che in gel filtrazione, mentre la PN2 ha un peso molecolare di 23.000 
daltons se analizzato in SDS-PAGE e di 45.000 daltons se si analizza lo 
stesso campione attraverso una gel filtrazione, suggerendoci quindi una 
struttura dimerica per la PN2. Questi enzimi richiedono Mg
2+
 per la loro 
attività, mentre i cationi dei metalli pesanti sono inibitori molto forti. 
L’attività degli enzimi è inibita da agenti che chelano i metalli ed è 
sensibile ai reagenti tioreattivi. Il punto isoelettrico è di 5.4 e l’attività 
ottimale si ha ad un pH di 7.5 per la PN1 e di 6.5 per la PN2 (Amici et al., 
1991, 1994). 
 
1.1.3 Dove vengono espresse 
Le 5’-Nucleotidasi sono largamente diffuse in natura ed esiste 
un’esauriente letteratura sull’enzima dai tessuti dei vertebrati, dal veleno 
dei serpenti, dal lievito e dai batteri. Sono state identificate tre 5’-
Nucleotidasi nel fegato dei mammiferi: una lisosomiale, una citoplasmatica 
e una legata alla membrana (Arsenis e Touster, 1968). Unico è l’enzima 
lisosomiale per il fatto che idrolizza ugualmente bene i mononucleotidi  2’-
,3’- e 5’-. Le 5’-nucleotidasi sono state trovate anche nella mucosa 
intestinale, nella ghiandola pituitaria, nel cervello, nel tessuto cardiaco e nel 
muscolo scheletrico (Drummonds e Yamamoto, 1971). 
 12
 
1.2 Patologia associata alla mancanza di PN1
I globuli rossi sopravvivono in circolo per un periodo compreso fra 
90 e 120 giorni. La durata di vita dei globuli rossi può accorciarsi in un 
notevole numero di disordini; qualora il midollo osseo non sia in grado di 
rimpiazzare adeguatamente gli eritrociti prematuramente distrutti, si 
sviluppa un’anemia. 
Le anemie emolitiche vengono generalmente distinte in base alla 
anomalia che causa la prematura distruzione dei globuli rossi. Dal punto di 
vista eziologico la distruzione dei globuli rossi può essere legata a: 
a) Un difetto molecolare (emoglobinopatia o enzimopatia). 
b) Un’anomalia nella struttura e nella funzione della membrana. 
c) Un fattore ambientale come un trauma meccanico o la presenza di 
autoanticorpi (Wendel Ross, H. Franklin Bunn). 
Un particolare tipo di enzimopatia che prendiamo in esame  e quella dovuta  
ad un’anomalia di uno degli enzimi del metabolismo nucleotidico. Questo 
enzima, chiamato pirimidina nucleotidasi (PN), interviene nel catabolismo 
degli acidi nucleici. 
 
 13
 
1.2.1 Fenotipo dei pazienti con mancanza della P5N di tipo I (PN1) 
In pazienti affetti da anemia emolitica non sferocitica si è potuto 
documentare sia un aumento del livello di nucleotidi pirimidinici 
all’interno degli eritrociti, riscontrabile in campioni deproteinizzati con la 
spettrofotometria (Valentine et al., 1974), e con l’analisi in h.p.l.c.  
(Simmonds et al., 1988), sia un decremento dell’attività  della PN1. Sembra 
quindi appropriata come diagnosi la mancanza dell’attività della PN1. Le 
emazie di tali soggetti sono riconoscibili per la presenza di una 
punteggiatura basofila dovuta ad un accumulo di nucleotidi pirimidinici e  
materiale ribonucleico, riscontrabile con la colorazione delle strisciate di 
sangue attraverso la tecnica di Wright. 
Attraverso i casi pubblicati, sono mostrate le caratteristiche di questa 
condizione patologica: moderata anemia (70-100 g/l), anisocitosi, 
reticulocitosi, punteggiatura basofila degli eritrociti, aumento del livello di 
bilirubina, uno spostamento del massimo di assorbimento dell’UV di 
campioni deproteinizzati di eritrociti da 260 mm a 265-270 mm. Sempre 
negli eritrociti abbiamo: un aumento del livello  di glutatione ridotto 
(GSH),   una riduzione dell’attività del ribosio fosfato pirofosfochinasi 
(RPK), un aumento del livello di nucleotidi pirimidinici e una riduzione 
dell’attività della PN1.  
Il fatto che molti altri stessi casi siano stati trovati dal 1974 in poi, 
vorrebbe dimostrare che la mancanza della PN1 non è una malattia 
 14
 
estremamente rara. Infatti, Beutler stabilì che la deficienza di PN1 è la 
quarta anemia emolitica più comune causata dalla mancanza di un enzima 
specifico, dopo altre patologie enzimatiche quali la mancanza del G-6-PD, 
del piruvato chinasi e del glucosio fosfato isomerasi (Beutler et al., 1980). 
Studiando geneticamente alcune famiglie di pazienti con la 
deficienza della PN1 sembra emergere che ci sia un’eredità autosomica 
recessiva per ciò che riguarda la trasmissione degli alleli coinvolti. Inoltre, 
in circa metà dei casi pubblicati, ci sono elementi di consanguineità. 
Sembra probabile l’esistenza di un polimorfismo genetico, considerando la 
distribuzione dell’attività dell’enzima tra omozigoti ed eterozigoti obbligati 
(Beutler et al., 1980).  
In un eritrocita normale i nucleotidi adeninici, costituiscono la più 
importante riserva energetica (circa il 97% dei nucleotidi totali) (Valentine 
et al., 1974), mentre i nucleotidi pirimidinici rappresentano una piccola 
frazione del totale. I nucleotidi pirimidinici derivano dal catabolismo degli 
RNA ribosomiali. Essi vengono defosforilati dalla PN1 e presumibilmente 
diffondono fuori dalla cellula una volta rilasciati i loro gruppi fosfato. 
Normalmente, la concentrazione dei nucleotidi pirimidinici all’interno 
degli eritrociti è molto bassa. Al contrario, negli eritrociti con la deficienza 
di PN1, presentano solo un 32% di nucleotidi adeninici, mentre le citidine e 
uridine costituiscono rispettivamente il 50% e 16% del pool nucleotidico. 
 15
 
La non funzionalità della PN1, che è un enzima citosolico, determina 
presumibilmente un accumulo di prodotti di degradazione ribosomale 
all’interno dell’eritrocita. 
1.3 Studi recenti sulla PN1  
Gli eritrociti durante la differenziazione terminale presentano 
un’elevata degradazione del loro RNA con il conseguente rilascio dei 
mononucleotidi (Rapoport, 1986). I mononucleotidi pirimidinici vengono 
degradati in maniera preferenziale da una PN1 specifica degli eritrociti; la 
mancanza di questo enzima causa un’anemia emolitica negli esseri umani. I 
globuli rossi che ne derivano mostrano un significante accumulo dei 
nucleotidi pirimidinici dovuto all’incompleta degradazione dell’RNA e 
dell’RNA ribosomiale; questo ci mostra l’importanza dell’attività svolta 
dall’enzima per la maturazione dei globuli rossi dal momento che l’enzima 
permette il rilascio dei nucleosidi che sono permeabili alla cellula. 
Particolari sulla regolazione dell’attività della PN1 e la sua influenza sul 
pool nucleotidico durante lo sviluppo eritroide sono sconosciuti. 
I dati sperimentali ci suggeriscono che l’attività della PN1 negli 
eritrociti immaturi aumenta in maniera rilevante. Infatti, tra la 17
a
 e 23
a
 
settimana di gestazione, l’attività della PN1 nei globuli rossi dei feti umani 
risulta essere tre volte maggiore rispetto a quella riscontrata nei globuli 
rossi degli adulti (Lestas et al., 1986). 
 16
 
Dallo studio del metabolismo eritrocitico embrionale in un altro 
organismo eucariota come il pulcino, si è dimostrato che l’adenosina 3’:5’-
ciclica monofosfato (cAMP) controlla molti aspetti di questo metabolismo 
durante la seconda metà dell’incubazione dell’uovo. Negli embrioni di 
pollo un aumento della concentrazione di cAMP negli eritrociti è dovuta ad 
un rapido incremento della norefinefrina (NE) nel plasma, attivando così 
l’adenilato ciclasi attraverso i recettori  -adrenergici (Dragon et al., 1995, 
1996). Lo stimolo fisiologico per il rilascio di NE è dato dall’ipossia. 
Questi eventi avvengono quando la concentrazione di UTP negli eritrociti 
dell’embrione diminuisce. Diversamente dal recettore  -adrenergico, si è 
trovato un recettore adenosinico A2R accoppiato con l’adenilato ciclasi. In 
vitro l’attivazione del recettore adenosina A2R induce lo stesso processo 
metabolico che si osserva con l’attivazione del recettore  -adrenergico 
(Glombitza et al., 1996). Inoltre si è analizzata l’attività dei due enzimi 
chiave del metabolismo pirimidinico, la pirimidina nucleoside fosforilasi 
(PNP) e la PN1 per vedere se i cambiamenti della loro attività enzimatica è 
correlata con il decrescere della concentrazione di UTP negli eritociti 
durante la differenziazione terminale e se le attività degli enzimi sono sotto 
controllo ormonale attraverso le catecolamine e le adenosine. I risultati 
mostrano che, durante la seconda settimana di incubazione l’UTP è la 
seconda più abbondante fonte di fosfato organico degli eritrociti 
dell’embrione. Questi ultimi presentano solo una minima attività della 
 17
 
PNP, escludendo quindi l’utilizzo di uridina da parte degli eritrociti. Al 
contrario, l’attività della PN1 aumenta significativamente tra il 13° e 15° 
giorno di sviluppo. L’incubazione per undici giorni degli eritrociti con un 
recettore  -adrenergico o adenosinico determinano la sintesi de novo 
dell’enzima (PN1), che a sua volta aumenta all’aumentare del rilascio di 
uridina nel mezzo d’incubazione. L’aumento dell’attività della PN1 alla 
fine della seconda settimana di incubazione è dovuta all’aumentare nel 
plasma del livello di catecolamine e alla conseguente attivazione dei 
recettori  -adrenergici. Inoltre, l’adenosina esterna potrebbe anch’essa 
contribuire all’attivazione della sintesi di PN1 attraverso il legame con i 
recettori A2R. I risultati ci mostrano che la sintesi della PN1 è 
particolarmente controllata dal cAMP durante la differenziazione terminale 
degli eritrociti e che l’enzima risulta essere un fattore limitante per il 
rilascio di uridina durante la maturazione eritrocitaria. 
 18
 
 
Figura. 1.1 Ruolo del cAMP e PN1 nel metabolismo eritrocitico durante 
la differenziazione terminale. NT, trasportatore nucleosidico; AC, adenilato 
ciclasi; β -R, recettore adrenergico; A, adenosina; A2R, recettore adenosinico; 
NE, norefrinefrina; G, proteina G. 
  
Queste conclusioni sono state fatte anche in un recente studio sugli 
eritrociti umani nucleati dell’embrione umano. I risultati possono essere 
applicati all’eritropoiesi nell’adulto. Nell’organismo adulto, le cellule 
eritroidi immature si sviluppano nel midollo osseo. La regolazione della 
PN1 durante le ultime fasi della differenziazione eritroide associato con la 
degradazione dell’RNA e un conseguente rilascio dei nucleosidi 
pirimidinici provvederebbe a determinare una effettiva via di recupero 
energetico che permette il trasferimento dei precursori dei nucleotidi 
pirimidinici alle cellule eritroidi in proliferazione durante i primi passaggi 
della differenziazione.