Progettazione di Sostituti Vascolari Ingegnerizzati

Progettazione di sostituti vascolari ingegnerizzati 
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Introduzione 
Le malattie cardiovascolari costituiscono la principale causa di morbilità e mortalità, in 
special modo nei paesi occidentali. Il ripristino della perfusione tissutale risulta di 
fondamentale importanza nel contesto clinico, rendendo necessario il reperimento di un 
numero sempre maggiore di condotti vascolari per ristabilire la pervietà dei vasi sanguigni o 
bypassare del tutto le regioni occluse. 
Le attuali tecniche di rivascolarizzazione consistono in angioplastica, posizionamento di uno 
stent o in un intervento chirurgico di bypass: gli innesti autologhi sono i condotti vascolari più 
comunemente usati, a motivo della loro immediata disponibilità e del minimo rischio di 
rigetto. Tuttavia, l’intervento di prelievo di questi vasi risulta spesso invasivo e circa un terzo 
dei pazienti che necessita di interventi di bypass soffre di patologie vascolari estese, che 
rendono i vasi sanguigni inadatti all’impiego in questi interventi. 
Polimeri sintetici come il polietilentereftalato (PET) ed il politetrafluoroetilene espanso 
(ePTFE) furono introdotti per la costruzione di protesi vascolari sintetiche come alternativa 
agli innesti autologhi e sono clinicamente approvati per condotti vascolari di grande diametro, 
ma mostrano un basso tasso di pervietà per innesti di piccolo calibro. Miglioramenti nelle 
prestazioni di questi vasi sanguigni sintetici sono stati ottenuti seminando sulla superficie 
luminale cellule endoteliali autologhe; nonostante questo le loro prestazioni non sono in grado 
di eguagliare quelle fornite dai vasi autologhi. Inoltre, nella popolazione pediatrica, si 
renderebbero necessarie più operazioni a mano a mano che i giovani pazienti crescono, a 
causa della mancanza di potenziale di crescita dei materiali sintetici. 
L’ingegneria dei tessuti è un campo interdisciplinare che applica i principi dell’ingegneria e 
della medicina allo sviluppo di sostituti biologici che ripristinano, mantengono o migliorano 
la funzione dei tessuti, ed offre dunque approcci promettenti per la generazione di condotti 
vascolari ingegnerizzati (TEVGs) biocompatibili che superano i limiti degli innesti sintetici. 
Questi sono in grado di integrarsi con il tessuto nativo del paziente senza provocare una 
reazione di rigetto immunologico e di resistere agli stress fisiologici del sistema vascolare.  
Il concetto generale di ingegneria dei tessuti vascolari comprende solitamente tre componenti 
principali: un materiale per la costruzione dello scaffold, un tipo cellulare per la semina ed un 
processo di rimodellamento guidato da segnali cellulari derivati dalle cellule seminate che 
depositano la matrice extracellulare e da cellule ospiti che formano il nuovo tessuto.  
Un TEVG, ripopolato con cellule per generare un materiale vivente che imita la struttura e la 
funzione dei vasi sanguigni nativi e che è capace di rimodellamento fisiologico, rappresenta
Introduzione 
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una soluzione attraente per il futuro della chirurgia vascolare. 
I primi vasi sanguigni ingegnerizzati furono realizzati da Weinberg e Bell nel 1986: essi 
consistevano in fibroblasti e fibre di gel di collagene, integrate con cellule endoteliali bovine, 
cellule muscolari lisce e una maglia di supporto in Dacron®. Da allora, numerosi sostituti 
vascolari ingegnerizzati sono stati sviluppati e valutati in modelli animali e in taluni casi sono 
stati fatti progressi in sperimentazioni cliniche. Gli studi clinici di maggior successo sono 
quelli condotti da Shinoka et al. (2001), che hanno impiegato TEVGs per il ripristino della 
circolazione venosa in bambini con cardiopatia congenita, e quelli condotti da Niklason et al. 
(2012) che hanno valutato shunt artero-venosi per l’emodialisi. 
Il fallimento dell’innesto vascolare è associato più comunemente a trombosi, iperplasia 
intimale o infezione, ed è talvolta dovuto alla dipendenza delle tecniche di produzione dei vasi 
sanguigni ingegnerizzati da una struttura di supporto, che si rende necessaria per fornire 
un’adeguata resistenza meccanica alla protesi.  
L’ingegneria dei tessuti mediante auto-assemblaggio (Tissue Engineering by Self-Assembly, 
TESA) rappresenta un approccio innovativo che si basa sulla capacità delle cellule di produrre 
una propria matrice extracellulare naturale, e può essere impiegata per generare strutture 
vascolari con un’adeguata resistenza meccanica senza che queste vengano riconosciute come 
estranee in vivo. L’applicazione clinica più importante di vasi sanguigni ingegnerizzati 
realizzati tramite tecniche di auto-assemblaggio è stata riportata dagli studi di L’Heureux et 
al. (2007), dimostrando un discreto successo ma evidenziando la necessità di reperimento di 
un elevato numero di cellule endoteliali e muscolari che producano matrice extracellulare.   
Una fonte cellulare adatta è fondamentale per impartire stabilità strutturale e facilitare 
l’integrazione in vivo delle protesi vascolari ingegnerizzate. Le cellule autologhe 
rappresentano una fonte cellulare di grande interesse perché riducono al minimo il rischio di 
rigetto dell’innesto. Tuttavia, l’isolamento e quindi l’espansione delle cellule del paziente non 
forniscono quantità cellulari adeguate ad un impiego per l’ingegneria dei tessuti, dato che i 
pazienti con malattie vascolari avanzate possiedono cellule con capacità di crescita ridotta e 
scarso potenziale rigenerativo. Nel caso di innesti biologici contenenti cellule autologhe 
differenziate terminalmente, la necessità di una procedura invasiva, il potenziale proliferativo 
relativamente basso e la difficoltà di ottenere un numero sufficiente di cellule da una piccola 
biopsia di tessuto rappresentano importanti limiti alla disponibilità di cellule endoteliali 
(ECs); inoltre, le cellule muscolari lisce (SMCs) nella popolazione anziana hanno limitata 
capacità proliferativa ed una  produzione di collagene notevolmente ridotta, il che 
compromette la  resistenza meccanica degli innesti ingegnerizzati.
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Gli studi più recenti si sono concentrati su metodi per il miglioramento della rigenerazione 
vascolare sperimentando approcci basati su cellule staminali, grazie alla loro capacità di auto-
rinnovarsi e di differenziarsi in vari lignaggi; il ruolo delle cellule staminali nella medicina 
rigenerativa è cruciale in quanto porta alla produzione di tipi di cellule di interesse e tessuti 
trapiantabili. Tuttavia, ogni tipologia di cellula staminale presenta difficoltà specifiche per 
l’isolamento, l’espansione, la differenziazione e l’applicazione clinica.  
Inizialmente le cellule staminali embrionali erano la fonte predominante di cellule staminali 
negli studi preclinici a motivo della loro pluripotenza. L’interesse scientifico si è poi spostato 
quando Yamanaka et al. (2006) hanno riportato un metodo per indurre pluripotenza nelle 
cellule somatiche dando origine a cellule staminali pluripotenti indotte (iPSCs).  
Oltre a questi due tipi di cellule staminali pluripotenti, gli sforzi della ricerca si concentrano 
anche su cellule staminali adulte multipotenti, in particolar modo le cellule staminali derivate 
dal midollo osseo (BMCs), dal momento che non mostrano alcuna rilevabile formazione di 
teratoma. Questa relativa sicurezza ha favorito l’applicazione terapeutica delle cellule 
staminali multipotenti adulte rispetto a qualsiasi altro tipo di cellule staminali.  
Mentre sono stati compiuti notevoli progressi nello sviluppo di vasi sanguigni ingegnerizzati e 
sono stati condotti studi clinici con buoni risultati, rimangono alcune sfide per poter generare 
protesi vascolari funzionali, tra cui la produzione di superfici non trombogeniche e non 
immunogeniche a contatto col sangue, lo sviluppo di innesti con proprietà meccaniche 
adeguate per resistere alle pressioni sanguigne fisiologiche, la ricerca di fonti cellulari 
adeguate ad un impiego clinico, con alto potenziale proliferativo e ridotta immunogenicità. 
Per un loro utilizzo su larga scala, gli innesti vascolari ingegnerizzati dovrebbero essere 
prontamente disponibili (off-the-shelf), con tempi di lavorazione limitati e costi competitivi 
rispetto alle altre procedure adottate.
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Capitolo 1. Cellule staminali 
 
1.1 Caratteristiche e tipologie 
Le cellule staminali sono cellule primitive ed indifferenziate con la capacità di dare origine a 
diverse tipologie di cellule dell’organismo; queste a loro volta vanno a costruire tutti i tessuti 
del corpo umano. Le cellule staminali possiedono quindi un grande potenziale terapeutico 
nell’ambito della rigenerazione e della riparazione tissutale.  
Per poter essere definite staminali, le cellule devono possedere due caratteristiche specifiche 
[1]:  
• l’autorinnovamento, ossia la capacità di auto-replicarsi e rinnovarsi per un numero 
illimitato di volte; 
• la pluripotenza, cioè la possibilità sia di dare origine ad altre cellule staminali 
identiche alla cellula madre sia di differenziarsi in cellule specializzate. 
Le cellule staminali possono essere divise in base alla loro diversa capacità differenziativa in 
quattro tipi principali: totipotenti, pluripotenti, multipotenti e unipotenti (Figura 1.1). Le 
cellule staminali totipotenti possiedono la capacità di differenziarsi in tutte le cellule 
dell’organismo, compresi i tessuti embrionali ed extra-embrionali; sono totipotenti lo zigote e 
le cellule embrionali nei primi stadi della divisione (fino a 2-4 cellule). Le cellule staminali 
pluripotenti hanno la capacità di differenziarsi per dare origine alla maggior parte dei tessuti 
dell’organismo; al contrario delle cellule staminali totipotenti, esse non sono però in grado di 
dare origine ai tessuti embrionali. Le cellule pluripotenti sono presenti nell’embrione solo per 
un breve lasso di tempo, prima di differenziarsi nelle più specializzate cellule staminali 
multipotenti. Le staminali multipotenti possono a loro volta differenziarsi in tutte le cellule 
del tessuto di appartenenza; sono multipotenti le cellule staminali del midollo osseo e le 
cellule del sangue del cordone ombelicale. Infine, le staminali unipotenti sono le cellule 
staminali meno versatili, in quanto sono capaci di differenziarsi in un solo tipo di cellula; un 
esempio di cellule staminali unipotenti sono gli epatociti, ovvero le cellule del fegato. 
L’ingegneria tissutale rappresenta uno dei più promettenti settori di applicazione delle cellule 
staminali: grazie alla loro capacità proliferativa e alla possibilità di differenziarsi in linee 
cellulari specializzate, le cellule staminali consentono di sfruttare una fonte idealmente 
infinita e rinnovabile di cellule di interesse e tessuti trapiantabili [2].  
L’approvvigionamento cellulare è attualmente uno dei principali problemi nell’ambito della 
medicina rigenerativa, principalmente a causa dell’insufficienza di donatori, della natura
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spesso invasiva della raccolta cellulare e delle problematiche che si possono manifestare nel 
tessuto espiantato: con l’aumentare dell’età del donatore diminuiscono infatti il potere 
proliferativo della cellula e la sua capacità di sintesi della matrice extracellulare, condizioni 
che incidono negativamente sulle proprietà meccaniche dei tessuti [3].  
Dati dunque la limitata capacità di propagazione ed il declino delle funzioni cellulari, si è reso 
necessario cercare fonti cellulari autologhe alternative; nella fattispecie, nella fabbricazione di 
sostituti per l’ingegneria dei tessuti vascolari viene attualmente valutato l’impiego di cellule 
staminali adulte multipotenti e cellule embrionali pluripotenti. 
 
 
Figura 1.1: Schema di differenziazione delle cellule staminali. 
 
1.2 Fonti di cellule staminali per vasi sanguigni ingegnerizzati 
La fonte ideale di cellule per l’endotelio vascolare e per il tessuto muscolare liscio dei vasi 
sanguigni ingegnerizzati dovrebbe essere autologa, capace di molte divisioni cellulari ed in 
grado di differenziarsi nel fenotipo maturo [4]. Sono stati usati diversi tipi di cellule nella 
preparazione dei TEVGs; la tipologia di cellule utilizzate influisce direttamente sulla struttura 
dell’innesto e conseguentemente sul suo comportamento in vivo. Una fonte cellulare 
promettente e ampiamente disponibile è rappresentata dalle cellule staminali adulte 
multipotenti, in grado di differenziarsi dalle cellule della parete vasale; in particolare, le 
cellule staminali mesenchimali del midollo osseo, del tessuto adiposo o del tessuto muscolare 
possono differenziarsi per formare un tipo di cellula dalle proprietà contrattili che riproducono 
quelle della muscolatura liscia dei vasi sanguigni [4]. Per quanto riguarda l’utilizzo,
Cellule staminali 
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nell’ambito dell’ingegneria tessutale vascolare, di cellule muscolari lisce derivate dalle cellule 
staminali pluripotenti, molte sono ancora le difficoltà da affrontare, prima tra tutte la 
formazione di teratomi. 
  
1.2.1 Cellule staminali embrionali 
Le cellule staminali embrionali (Embryonic Stem cells, ES cells) sono cellule pluripotenti 
isolate dalla massa cellulare interna degli embrioni allo stadio di blastocisti preimpianto, sia 
nel topo che nell’uomo [5] (Figura 1.2). Esse possiedono capacità distintive di 
autorinnovamento, pluripotenza e stabilità genomica ed hanno la capacità di dare origine a 
tutti e tre gli strati germinali, cioè ectoderma, mesoderma ed endoderma e potrebbero dunque 
consentire la produzione di tessuti specifici abbinati alle esigenze del paziente [2]. Le cellule 
ES possono essere mantenute per lunghi periodi di coltura, fornendo grandi quantità di cellule 
che, a differenza delle cellule staminali multipotenti, non possono essere derivate direttamente 
da una fonte di tessuto [12]. Uno dei requisiti fondamentali per lavorare con le cellule ES 
consiste dunque nella capacità di controllarne la differenziazione nei lignaggi di tessuto 
desiderati. Gli embrioni preimpianto contengono nella massa cellulare interna circa il 10-15% 
di cellule pluripotenti; queste cellule possono essere isolate, quindi coltivate su uno strato di 
cellule (feeder cells) che forniscono un ambiente favorevole all’auto-rinnovamento [1,5].  
Lo sviluppo di condizioni di coltura su larga scala in grado di preservare lo stato 
indifferenziato delle cellule ES costituisce ancora una sfida [5]. Vi è un notevole interesse 
all’utilizzo delle cellule staminali embrionali, specialmente per la loro potenziale applicazione 
in una grande varietà di ambiti, tra cui la scoperta di nuovi farmaci, l’immunoterapia e 
naturalmente la medicina rigenerativa.  
Sebbene la ricerca in questo campo sia molto attiva, l’uso di cellule ES nell’indagine clinica è 
ostacolato dal loro potenziale tumorigenico, dalla difficoltà di ottenere ovociti umani di 
qualità e soprattutto dalle considerazioni etiche nell’isolare le cellule ES da un embrione 
umano fecondato. Per aggirare i problemi dovuti alle questioni etiche e pratiche nell’uso delle 
cellule staminali embrionali, un grande contributo è dato dalla tecnologia delle cellule 
staminali pluripotenti indotte.