Indagine molecolare su alcune popolazioni di Stenasellus Racovitzai mediante marcatori Rapd

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climatici o geologici. 
Per altri autori (Stock ,1977, Botosaneanu & Holsinger, 1991) il passaggio da 
acque marine ad acque sotterranee è avvenuto in modo passivo in seguito a 
regressioni marine, eventi paleogeografici e climatici, che avrebbero portato gli 
antenati marini alla colonizzazione, prima dell’ambiente interstiziale e 
successivamente di quello delle acque sotterranee. Anche se, prudentemente, Stock 
non entra nel merito della colonizzazione attiva o passiva, ma propone che, essendo 
gli animali stigobi forme relitte, si siano trovate in condizione di poter colonizzare gli 
ambienti ipogei a seguito di regressioni marine. 
Altri autori ancora (Boutin & Coineau,1990), riuniscono i due filoni di 
pensiero precedenti in un modello, il «Two step model of evolution» che, ripreso in 
parte anche da altri autori (Notemboom, 1991) prevede la colonizzazione, da parte 
del progenitore marino, degli ambienti acquatici ipogei attraverso due transizioni, 
una orizzontale ed una verticale. Dopo una colonizzazione delle acque dolci 
superficiali (transizione orizzontale), è prevedibile una seconda fase (transizione 
verticale) di penetrazione nell’acquifero sotterraneo. 
Alternativamente , altre popolazioni possono aver usato prima una transizione 
verticale, nel passaggio da forme marine di superficie a forme  interstiziali marine o 
litorali e solo successivamente aver operato una transizione orizzontale colonizzando 
le acque dolci sotterranee. (Fig. 2) 
 7
 
 
Fig. 2: Two Step Model of Evolution(da Boutin & Coineau, 1990, modificato). 
Ogni transizione è resa possibile da un certo numero di preadattamenti e da 
un’attiva fase di ricerca di nicchie ecologiche libere. 
La particolare specializzazione ecologica della famiglia Stenasellidae, la sua 
distribuzione mondiale, la mancanza di parenti epigei ed alcuni caratteri plesiomorfi 
(esopoditi rudimentali sulla seconda antenna, due pleoniti liberi e ben sviluppati), 
suggeriscono che la separazione dal presumibile capostipite ancestrale, deve essere 
avvenuta in tempi molto remoti ed a seguito di eventi paleogeografici e climatici 
(Magniez, 1981, 1999, Messana et al, 1995, Ketmaier et al, 1998, 1999, 2000). 
Il Genere Stenasellus, Dollfus 1897, è presente nelle regioni Paleartica, Afrotropica 
ed Orientale. 
La fauna europea comprende diverse specie appartenenti al genere Stenasellus (da 
Botosaneanu, 1986): 
• Stenasellus virei Dollfus 1897, con quattro sottospecie (S.virei buchneri 
Stammer, 1936, S.virei angelieri Magniez, 1968, S.virei boui Magiez,1968, 
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S.virei hussoni Magniez, 1968) distribuite nella Francia Sudoccidentale e nel 
Nord della Spagna. 
• Stenasellus buili Remy, 1949, in Francia meridionale. 
• Stenasellus bragai Magniez, 1976, Stenasellus escolai Magniez 1976, Stenasellus 
magniezi Escolà, 1976, nel Sud della Spagna. 
• Stenasellus galhanoae Braga, 1962 e Stenasellus nobrei Braga, 1942, in 
Portogallo. 
• Stenasellus racovitzai Razzauti, 1925, in Toscana, Sardegna e Corsica, 
• Stenasellus nuragicus Argano, 1968, Stenasellus assorgiai Argano, 1968, in 
Sardegna. 
Stenasellus racovitzai fu rinvenuto per la prima volta in Toscana nel 1923 da 
Razzauti in una grotta denominata «Buca del Danese» nei pressi di Roselle (Gr). 
Successivamente a partire dagli anni ’50 sono 
stati ritrovati altri esemplari in varie località della 
Sardegna e della Corsica (Magniez, 1981), sia in 
ambienti carsici che freatici, fino agli ultimi 
ritrovamenti in Toscana, nel «Fontanile dei 
Cavalleggeri», all’interno del Parco Regionale 
della Maremma (Gr). Gli individui delle 
popolazioni del gruppo racovitzai non differiscono 
tra loro, e sono state tutte deteminate come S. 
racovitzai da Magniez (1976). 
 
Fig.3: Stenasellus racovitzai, 
Razzauti 1925 
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Come Stenasellus virei, Dollfus 1897, una 
specie presente in Francia, S. racovitzai viene 
considerata una specie politipica comprendente più 
linee isolate geograficamente da molto tempo, ed è 
una forma soprattutto interstiziale ed 
eccezionalmente cavernicola (Magniez, 1976). 
La distribuzione attuale di S. racovitzai è 
probabilmente dovuta ad eventi paleogeografici, che 
portarono l’antenato Stenasellidae presente in 
Francia meridionale, prima a colonizzare la microplacca Sardo-Corsa e 
successivamente la Toscana (Magniez 1981, 1983, Messana et al.,1995, Ketmaier et 
al, 1998, 1999, 2000). 
 
1.2 CENNI PALEOGEOGRAFICI 
La distrubuzione odierna di S.racovtzai è ad eventi paleogegrafici che hanno 
caratterizzato il Mediterraneo nel corso del Terziario (65 – 3,4 milioni di anni fa, ma) 
e durante le fasi glaciali plio-pleistoceniche (5,2 – 1,64 ma). Per meglio comprendere 
come questi animali si siano distribuiti, dobbiamo analizzare, brevemente, gli eventi 
paleogeografici che hanno interessato l’area Mediterranea, in particolare della parte 
Tirrenica, dal Terziario ad oggi. 
I biogeografi della fine dell’ottocento, notarono che la fauna delle isole 
maggiori del mediterraneo presentava alcune similitudini con quella delle zone 
costiere continentali. L’ipotesi, che fu proposta all’epoca, prevedeva l’esistenza nel 
Terziario di un vasto continente, la Tirrenide (60,5 ma), che copriva quasi tutta l’area 
 
Fig.4: Distribuzione odierna di S.
racovitzai 
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occidentale del Mediterraneo, connettendo tra di loro Africa settentrionale, Europa 
sud occidentale, Corsica, Sardegna, l’arcipelago toscano e parte della Toscana 
(Forsyth Major, 1882, 1883), la cui disgregazione sarebbe avvenuta nell’Aquitaniano 
(23.3 - 21.5 ma), cioè nel Miocene inferiore (Furon, 1950, 1951, 1959). A sostegno 
di questa ipotesi esistono solo poche convalide. A partire dalla fine degli anni ’60, 
nuove scoperte geofisiche hanno indotto a riconsiderare gli eventi geodinamici degli 
ultimi trenta-quaranta milioni di anni (ma) con la seguente cronologia (Boccaletti et 
al, 1990): 
OLIGOCENE (35,4 – 29,3 MA) 
Lo scorrimento della placca africana verso Est, rispetto all’Europa, provoca la 
frammentazione della catena Alpidica, e di Baleari e Corsasardinia dall’Europa 
meridionale, con conseguente migrazione di alcuni frammenti verso Sud e Sud-Est. 
La Corsica e la Sardegna, collegate al massiccio Calabro-peloritano, si spostano 
ruotando, in senso antiorario (30° per la Corsica e 64° per la Sardegna) staccandosi 
dall’attuale Provenza. Evento che è probabilmente avvenuto nell’Aquitaniano ovvero 
tra i 23,3 ed i 21,5 milioni di anni fa (Alvarez, 1972, 1974). Lo spostamento di queste 
microplacche, ed il conseguente accumulo di materiale alla deriva, è la causa della 
formazione della catena appenninica, al contatto con il promontorio Adriatico, e di 
quella maghrebina al contatto con l’Africa. Le Alpi e l’Appennino non sono, in 
questa fase, ben differenziati ma costituiscono un unico insieme montuoso. In 
comunicazione, o immediatamente adiacente, all’Appennino è presente una grande 
area calcarea sita nella zona oggi occupata dalle isole di Giannutri, Elba, Giglio ed 
Argentario. Questa vasta area sprofondò nel Miocene superiore (Tortoniano, 10,4-6,7 
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ma) a seguito della tettonica distensiva tra Corsica e Toscana.  
 
 
 
Fig.5: Rotazione della Microplacca Sardo-Corsica. 
Al periodo corrispondente al Messiniano (Miocene superiore, 6,7-5,2 ma), si fa 
risalire l’evento del prosciugamento del Mediterraneo. Tale fenomeno dovuto ad un 
deficit idrico a causa della chiusura dello stretto di Gibilterra ad Ovest, della Tedide 
ad Est e della fine dei collegamenti con l’Oceano Indiano a Sud-Est, trasformando il 
Mediterraneo in un enorme lago. La chiusura ha avuto come conseguenza il 
prosciugamento grazie ad una lenta evaporazione delle acque (Hsu et al., 1973). 
Durante questo periodo noto come «crisi di salinità del mediterraneo», si aprirono 
ampie connessioni terrestri tra appennino ed arcipelago toscano, e tra questo e la 
Corsica. 
PLIOCENE (5,2 - 3,4 MA) 
Questo periodo è caratterizzato dal ripristino delle comunicazioni idriche tra 
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Mediterraneo ed Oceano Atlantico, grazie alla riapertura dello stretto di Gibilterra, 
quindi in questa fase il Mediterraneo si riempie. 
Durante la parte iniziale del Pliocene medio in Toscana è caratterizzata da una 
fase marina regressiva. La Toscana in questo periodo si presenta essenzialmente 
come una pianura, in corrispondenza delle fosse tettoniche riempite da sedimenti 
marini del Pliocene inferiore. Questa pianura è alternata da alcuni rilievi, che sono le 
antiche isole come, ad esempio, i Monti Livornesi. Non è ancora del tutto chiaro 
quanto ad occidente si sia spinta questa regressione (Mazzanti, 1984). 
QUATERNARIO (1,64 – 0,00 ma) 
Il Quaternario ha avuto grande importanza nel caratterizzare flora e fauna 
attuali, infatti, questo è il periodo delle glaciazioni, che hanno portato anche a 
variazioni del livello medio delle acque del Mar Mediterraneo. Le glaciazioni sono 
state un evento che ha modificato drasticamente l’areale di distribuzione delle specie 
animali e vegetali, alcune scomparvero altre sono presenti oggi come forme relitte. 
Non solo le glaciazioni caratterizzano il Quaternario, rilevanti sono anche i 
movimenti tettonici di assestamento, movimenti sismici ed eruzioni vulcaniche 
frequenti. È molto dubbia l’ipotesi che ci siano stati contatti tra Corsardinia ed Isola 
d’Elba nel periodo pleistocenico (1,64 – 0,01 ma), dato che il canale tra loro è andato 
incontro ad un graduale approfondimento a partire dal Miocene, e che le variazioni 
del livello del mare non hanno superato i + / - 100-150m. La profondità marina 
attuale, tra l’area sardo-corsa e l’Elba, è di circa 500m; non sembra possibile, quindi, 
che una qualsiasi glaciazione possa aver messo in contatto le due terre. Il contatto, se 
c’è stato, è avvenuto indirettamente e per un tempo limitato durante la glaciazione 
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Mindel, tramite l’isola di Capraia, date le basse profondità tra questa, l’Elba e Capo 
Corso (dai 200 ai 358 m). 
Per quel che riguarda la specie S. racovitzai, nel suo lavoro del 1983 Magniez, 
propose l’ipotesi, secondo la quale, una popolazione progenitrice fosse presente 
inizialmente in Provenza. Da qui sarebbe passata, in quelle che sarebbero poi 
divenute la Corsica e la Sardegna. La microplacca si staccò, come detto, 
nell’Aquitaniano (23,3 – 21,5 ma). In seguito alla rotazione, venne successivamente 
(Pliocene, 5,2 - 3,4 ma) a scontrarsi con quelle che diventarono le isole fossili della 
Maremma (Lanza, 1984), permettendo una continuità di falda e la colonizzazione 
della Toscana meridionale da parte della popolazione ancestrale originaria, 
differenziatasi, poi, in S. racovitzai. Nonostante siano molto difficili da trovare, i 
rappresentanti di questa specie sono sicuramente (grazie alle loro caratteristiche 
biologiche) degli indicatori della storia paleogeografica del mediterraneo (Magniez, 
1981, Messana et al., 1995). Sono infatti forme relitte, stenoece, hanno una limitata 
capacità di dispersione, un alto grado di specializzazione stigobia e come già detto 
con caratteri morfologici primitivi. 
Gli studi che sono stati effettuati precedentemente sulle popolazioni di 
Sardegna e Corsica, sono state condotte con metodologie morfologiche ed 
elettroforetiche, ormai affermate. 
L’analisi morfologica classica non ha rilevato differenze sostanziali tra le 
popolazioni di S. racovitzai di Sardegna, Corsica e Toscana. 
Studi di tipo enzimatico sono stati effettuati sulla specie (Messana et al., 1995, 
Ketmaier et al., 1998, 1999, 2000), in cui sono state confrontate le popolazioni 
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toscane con quelle sarde. Da questi è stata evidenziata una distanza genetica, D 
ottenuta con l’indice di Nei (1978), tra le popolazioni sarde e le due popolazioni 
toscane (D=1,05 – 1,305), queste ultime sono più vicine tra loro (D=0,177). Anche le 
distanze tra le popolazioni toscane e quelle corse, determinate nel lavoro di Ketmaier 
et al.(2000), sono notevoli in quanto variano da D=0,983 a D=1,280. 
L’analisi di tipo elettroforetico è un’indagine dei patterns enzimatici che sono 
espressioni della variazione dei geni che codificano le proteine. Le mutazioni a 
carico dei geni codificanti per le proteine, come la maggior parte dei geni codificanti 
tendono ad essere fissate molto lentamente, in quanto il mal o non funzionamento 
anche di una sola di esse può compromettere la fitness. Le mutazioni tenderanno a 
fissarsi, ovvero, ad essere ereditabili, solo se queste portano ad un effettivo vantaggio 
all’animale o se avvengono nel genoma non codificante. 
Esistono zone del DNA che non codificano, con tassi di mutazione più alti, che 
non possono essere rilevate dalla tecnica elettroforetica. 
È intuitivo il vantaggio di includere anche il genoma non codificante nelle 
analisi, inoltre, le tecniche enzimatiche hanno necessità di un numero ed un 
quantitativo di campione molto maggiore rispetto alle tecniche di indagine del DNA, 
ed i campioni, nel nostro caso, non sono facili da reperire, anche in numero limitato. 
Prendendo spunto dai lavori precedentemente citati, che hanno impiegato 
tecniche allozimatiche, è stata sentita l’esigenza di valutare S. racovitzai alla luce di 
tecniche molecolari che ne indagassero direttamente il genoma codificante e non. 
 
 15
 
1.3 ANALISI MOLECOLARE MEDIANTE TECNICA RAPD 
 
L’analisi molecolare su DNA può essere effettuta con varie tecniche, ma 
genomi sconosciuti, come quello di S. racovitzai, sono analizzati bene mediante la 
tecnica RAPD (Random Amplified Polymorphic DNA). 
La tecnica RAPD fu ideata e sviluppata, indipendentemente in due distinti 
laboratori (Williams J.G.K. et al 1990, da Welsh & McClelland 1990). Questo 
metodo era innovativo, perché in grado di valutare polimorfismi del DNA, attraverso 
l’amplificazione di DNA genomico tramite PCR (Polymerase Chain Reaction) 
utilizzando singoli primers di sequenza arbitraria. 
In questa reazione il primer utilizzato si lega al DNA in due siti diversi dei 
filamenti opposti e se il frammento compreso tra i due siti non è troppo lungo, 
l’amplificazione produrrà quantità rilevabili di DNA. Quello che si ottiene 
dall’amplificazione dei filamenti di DNA è una serie di filamenti di diverso peso 
molecolare che sono poi evidenziati mediante elettroforesi su gel di agarosio. I 
frammenti vengono discriminati sulla base del peso molecolare ed appaiono come 
bande luminose alla radiazione utravioletta. L’insieme delle bande relative ad un 
individuo costituiscono il pattern (o modello) di amplificazione caratteristico per 
quel DNA e quel primer. 
La tecnica prevede l’impiego delle bande basandosi sulla loro presenza/assenza 
per determinare le distanze genetiche tra gli individui esaminati. 
 16
 
 
Fig.6: Legame Primer/Filamento di DNA. 
Gli autori della tecnica l’hanno definita utile nel generare markers genetici, in 
quanto discrimina i polimorfismi del DNA, mediante amplificazione casuale di 
porzioni di DNA. 
Polimorfismo significa la presenza per lo stesso gene, o porzione di DNA, di 
due o più alleli, ovvero due o più forme alternative, con una frequenza tale che non 
possono essere dovute a mutazione spontanea ricorrente (Polsinelli et al., 1992). 
Sorgenti di polimorfismo possono essere mutazioni puntiformi, delezioni in 
corrispondenza del sito di attacco del primer, inserzioni che rendono il sito di attacco 
troppo distante per consentire l’amplificazione o inserzioni che rendono il segmento 
differente in dimensioni senza impedire l’amplificazione. 
I ricercatori che hanno inventato la tecnica, hanno effettuato studi relativi alle 
caratteristiche degli oligonucleotidi utilizzati per innescare la reazione di 
amplificazione. Dati importanti sono stati ricavati relativamente al contenuto in 
Guanina (G) e Citosina (C) dei primers utilizzati nell’amplificazione; Williams et al 
(1990) riportano nel loro lavoro esperimenti svolti con contenuti di G e C negli 
oligonucleotidi che variavano da zero al 100%. La conclusione alla quale sono 
arrivati è che il minimo contenuto di GC sufficiente per ottenere un’amplificazione 
RAPD è del 40%, oltre ad una lunghezza minima del primer di nove nucleotidi. 
Inoltre usando primers che differivano per un solo nucleotide, ottenevano patterns 
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diversi, diversità meno accentuata nel caso di sostituzioni in posizione 5’. Questo 
dimostra che, analogamente, la mutazione di una singola base nei tratti del genoma, 
ai quali il primer si attacca, può impedire l’amplificazione di questi, si viene a creare 
cioè un disappaiamento tra le sequenze dei siti d’attacco del primer ed il primer 
stesso. 
Dopo l’uscita di questi articoli è iniziata una produzione molto ricca nel campo 
della biologia molecolare relativamente all’uso dei RAPD. Uno dei primi lavori di 
applicazione della tecnica a problematiche di carattere filogenetico, è quello di 
Wilkerson et al. del 1993 nei Ditteri, in due specie del genere Anopheles. In questo 
studio le due specie di laboratorio, che erano morfologicamente indistinguibili, 
furono distinte sulla base del pattern RAPD. Gli autori, infatti, sono riusciti ad 
utilizzare i RAPD per affermare una loro possibile recente separazione. 
A fronte di un discreto numero di lavori pubblicati sull’applicazione della 
tecnica RAPD sul subphylum Crustacea, sull’ordine degli Isopodi la letteratura non è 
molto ampia, Dalens et al (1996) confrontarono tre diverse specie del genere 
Oritoniscus (Isopoda) mediante la tecniche morfometrica, allozimatica e RAPD. I 
dati RAPDs sono, in questo lavoro, presi in considerazione per concludere che le tre 
specie, che vivono quasi in simpatria, sono ben distinte. 
Baratti et al. (1999), hanno utilizzato la tecnica RAPD su Stenasellus 
racovitzai, utilizzando cinque primers e confrontando entrambe le popolazioni 
toscane con una corsa, determinando che le popolazioni della Toscana sono la stessa 
specie e che geneticamente distano poco (D=0,175).  
La validità della tecnica RAPD nello studio della variabilità genetica e 
 18
 
nell’analisi filogenetica di generi, specie o popolazioni, è stata valutata confrontando 
i risultati di questa nuova tecnica con quelle già ampiamente in uso. Tibayrec M. et 
al (1993) effettuarono su sei specie di protozoi parassiti una duplice indagine, la 
prima tramite RAPD, la seconda con il metodo enzimatico multilocus tramite 
elettroforesi. Il risultato cui pervennero fu quello di un’assoluta coincidenza delle 
distanze genetiche (utilizzando l’indice di Jaccard) tra le varie specie, calcolate con i 
due metodi. 
 
1.4 VANTAGGI E SVANTAGGI DELLA TECNICA RAPD 
 
Tra i vantaggi maggiori che si possono riconoscere alla tecnica sono 
essenzialmente la possibilità di ottenere un’informazione genetica senza bisogno di 
ulteriori informazioni sul genoma, e capacità di ottenere polimorfismi genetici, senza 
una selezione a priori delle porzioni del genoma in studio. Infatti i patterns genetici 
RAPDs riflettono variazioni sia nei loci codificanti che non, sia nei loci mitocondriali 
(o del cloroplasto) che nucleari. Questo spesso aumenta la possibilità rilevare 
differenze a livello intraspecifico, rispetto ad esempio, a tecniche come l’elettroforesi 
di allozimi (Isabel et al., 1995, Nusser et al., 1996; Thomas et al., 1997, , Buso et al., 
1998, Jenczenski et al., 1999). In pratica con questa tecnica vengono amplificate 
delle porzioni genomiche che rimangono sconosciute, a meno che non si proceda con 
ulteriori analisi molecolari. 
Fino alla messa a punto della tecnica RAPD, i metodi molecolari disponibili, 
per evidenziare polimorfismi genetici, erano, molto laboriosi (ad esempio RFLP con 
Southern blotting) e richiedevano informazioni a priori del DNA in studio, con costi 
 19
 
spesso proibitivi. 
I prodotti dell’amplificazione ottenuti con il metodo RAPD sono porzioni 
anonime di DNA, dato che i primers amplificano qualsiasi DNA a prescindere dalla 
provenienza, ovvero impurità, infezioni e parassiti eventualmente presenti nei 
campioni da cui è stato estratto. Questo, può non creare problemi se il DNA 
indesiderato, eventualmente presente, è sufficientemente diluito. 
Un’obiezione che sovente viene sollevata, sull’impiego dei primers RAPD 
come markers, è la riproducibilità, base fondamentale di ogni ricerca scientifica. Per 
poter essere accettato, il pattern di un primer, deve essere confermato da almeno atre 
due reazioni successive. Wilkerson R.C. et al (1993) sollevarono il problema della 
scelta dei markers adatti; infatti, non tutti i primers decameri con alta prevalenza di 
Guanina e Citosina possono essere utilizzati nell’analisi RAPD. Spesso, i primers 
sono scelti dopo uno screening iniziale, solo se riproducibili, ed utilizzati quindi 
come markers. In caso di assenza di bande comuni tra due specie molto affini o tra 
due popolazioni della stessa specie, il primer, secondo gli autori, non dovrebbe essere 
impiegato come marker. 
Jones et al nel 1998, effettuando prove RAPDs, rigidamente alle stesse 
condizioni, in nove laboratori diversi sparsi per l’Europa, trovarono che non si 
produceva sempre lo stesso pattern, concludendo che la tecnica in questione ha sì 
molte applicazioni ma che non può essere utilizzata nei laboratori che necessitano di 
scambiarsi dati o farne dei collage; gli autori aggiungono che non è facile ottenere la 
riproducibilità se viene cambiato il materiale di consumo, oppure il personale.