Rilevazione di Ocratossina A mediante QCM e SPR

Biosensori 
1.1 I biosensori 
Secondo la definizione dell‟Unione Internazionale di Chimica Pura e Applicata (IUPAC), per 
biosensore si intende un dispositivo in grado di utilizzare una specifica reazione biochimica mediata 
da componenti biologiche quali biomolecole, tessuti, organelli o cellule intere, per la rilevazione di 
composti chimici attraverso la conversione in un determinato segnale analitico, che può essere 
ottico, elettrico, termico o acustico.  
Rispetto alle tecniche analitiche tradizionali, un biosensore ha la capacità di non richiedere lunghe 
fasi di purificazione dei campioni o l‟aggiunta di reagenti; inoltre può permettere l‟esecuzione in 
tempo reale, in loco, di analisi mediche o ambientali. La principale caratteristica di un biosensore è 
la specificità, ovvero la capacità di reagire prevalentemente con un solo tipo di analita e non con 
altri che possono essere presenti nell‟ambiente di misura. Questi ultimi quindi non contribuiscono a 
determinarne il segnale di risposta. Altre caratteristiche che rendono ideale un biosensore sono l‟alta 
sensibilità, i bassi tempi di risposta, l‟economicità e la robustezza.  
Il termine biosensore fu coniato da Leland Clark che nel 1953 aveva già messo a punto il 
polarografo, un elettrodo per la misura dell‟ossigeno. Tale elettrodo possiede sia il catodo che 
l‟anodo all‟interno di una membrana isolante di polietilene che copre uno strato di un elettrolita. 
L‟ossigeno diffonde attraverso la membrana e viene ridotto al catodo. Tutto ciò risulta in un flusso 
di corrente proporzionale alla quantità di ossigeno presente nel campione (Clark et al., 1953).  
Agli inizi degli anni '60 Clark e Lyons (Clark et al., 1962) pensarono di unire la selettività 
dell‟elettrodo con la specificità caratteristica di un enzima costruendo di fatto il primo biosensore: 
un elettrodo ad enzima per la misura del glucosio in soluzioni biologiche, che utilizza la glucosio 
ossidasi (GOD) come elemento di riconoscimento. 
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Fig.1.1: Sensore di Clark: A) elettrodo di Pt; (B) elettrodo di Ag/AgCl; (C) soluzione di KCl; (D) membrana; (E) 
anello di gomma; (F) potenziostato; (G) galvanometro 
 
La reazione catalizzata dall‟enzima Glucosio ossidasi (GOD) è la seguente: 
 
D-Glucosio + O2 → H2O2 + D-Gluconolattone 
seguita dall‟idrolisi non enzimatica: 
D-Gluconolattone + H2O → Acido D-Gluconico 
 
Il segnale amperometrico derivante dalla reazione può essere utilizzato per monitorare la quantità di 
ossigeno in base alla relazione stechiometrica coinvolta. Successivamente negli anni seguenti 
Guilbault e Montalvo (Guilbault et al., 1969) descrissero la realizzazione di un biosensore per la 
misura dell‟urea. La storia dello sviluppo dei biosensori ha aperto la strada al campo dei termistori 
enzimatici (Mosbach et al., 1974), dei biosensori microbici
 
(Divis et al., 1975), degli 
immunosensori (Liedberg et al., 1983), dei nano biosensori
 
(Vo-Dinh et al., 2000), dei biosensori 
basati su cellule (Pancrazio et al.,1998) e di saggi di binding di acidi nucleici (Edman et al.,1997). 
Grazie ai continui sviluppi questi dispositivi sono oggi sempre più presenti e applicati. 
 
In campo analitico esistono tre tipi diversi di biosensori: di prima, di seconda e di terza generazione. 
Nei biosensori di prima generazione l‟enzima ossida il substrato in presenza di ossigeno e la 
diminuzione della concentrazione di ossigeno viene direttamente rivelata all‟elettrodo. In quelli di 
seconda generazione è prevista la presenza di un mediatore redox direttamente a contatto con 
l‟elettrodo, un esempio è dato dalla coppia Fe
2+
/Fe
3+
. Questo mediatore, sempre in presenza di 
ossigeno, va a reagire chimicamente con il prodotto della catalisi enzimatica fornendo una risposta 
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direttamente proporzionale alla concentrazione del substrato che si vuole determinare. Nei 
biosensori di terza generazione si osserva invece una elettrochimica diretta, ovvero ci sono elettrodi 
che promuovono l‟ossidazione e la riduzione senza l‟aggiunta di altri sostituenti in soluzione, come 
mediatori naturali o artificiali. Il trasferimento elettronico diretto tra il sito enzimatico e il 
trasduttore avviene grazie alla presenza di composti organici particolari, un esempio è dato dal sale 
che si forma mescolando TCNQ (tetracianochinodimetano) e TTF (tetratiofulvalene) (Ferraris et al., 
1973). 
1.2 Miniaturizzazione e Lab-on-a-chip 
Negli ultimi decenni la miniaturizzazione delle tecniche analitiche è diventata un trend dominante 
nella ricerca, rinforzato anche dalla partecipazione dell‟industria. L‟idea della miniaturizzazione dei 
sistemi analitici circolava da anni, ma solo con l‟arrivo della fotolitografia per la costruzione di 
circuiti integrati è stata resa fattibile (Harrison et al., 1998) e ciò ha dato il via allo sviluppo di una 
marea di applicazioni. Così come i circuiti integrati hanno permesso la miniaturizzazione di 
computer grandi quanto una stanza alle dimensioni di un notebook, la miniaturizzazione ha il 
potenziale di condensare un‟enorme quantità di strumenti in un lab-on-a-chip (Manz et al.; 1990). 
Una loro particolarità è che oltre ad essere più veloci ed economici, questi nuovi dispositivi hanno 
consentito nuove tipologie di esperimenti altrimenti impossibili da svolgere con la classica 
strumentazione su larga scala. I lab-on-a-chip sono stati inizialmente accolti con scetticismo a causa 
dell‟indisponibilità di componenti micro-fabbricati: a quel tempo solo serbatoi e canali potevano 
essere preparati attraverso la litografia. Successivamente nuovi componenti come valvole, camere 
di reazione e sistemi di detection hanno permesso lo sviluppo di sistemi semplici in prototipi di lab-
on-a-chip (Quin et al., 1998).  
I lab-on-a-chip presentano molti vantaggi rispetto ai tradizionali laboratori chimici e biologici. 
Caratteristica peculiare è un consumo ridotto di campioni e reagenti: i dispositivi microfluidici ad 
esempio, avendo un volume interno di pochi microlitri, necessitano di una quantità di sostanze 
minore rispetto agli strumenti tradizionali. La possibilità di utilizzare piccole dosi di fluidi negli 
esperimenti è di grande importanza in molte applicazioni biologiche in cui i reagenti possono essere 
molto costosi e i campioni a disposizione sono spesso limitati. I dispositivi microfluidici 
consentono di trasportare i fluidi con poche componenti meccaniche; la complessità delle strutture 
può essere significativamente ridotta così come il consumo di potenza e il costo, mantenuto basso 
dal fatto che è possibile una produzione su larga scala attraverso tecniche di replicazione 
standardizzate (Kim et al., 2002). È possibile integrare tutti i passi di un'analisi in un singolo chip, 
dal caricamento del campione al lavaggio, dalle reazioni al rilevamento e così via (Martinez et al., 
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2009). Questa integrazione limita l'errore dell'operatore, la possibile contaminazione dell'ambiente 
di lavoro e il tempo di analisi, diminuito anche dalla possibilità di condurre più processi in parallelo 
su un singolo chip e dal fatto che riscaldamento, miscelamento e misurazioni possono venire 
effettuate più accuratamente e rapidamente in volumi più piccoli, permettendo un'analisi in tempo 
reale (Ahn et al., 2004). Generalmente si tratta di dispositivi usa e getta e in futuro si prevede che le 
analisi che richiedono un certo dispendio di tempo e che ora si fanno in ospedale, si faranno su un 
chip microfluidico in grado di fornire dati in real-time.  
Le principali applicazioni dei lab-on-a-chip si trovano nelle scienze biologiche e biotecnologiche: 
diagnostica medica, colture cellulari, sequenziamento genetico, proteomica e studi per nuovi 
medicinali. Come detto in precedenza i dispositivi microfluidici offrono nuove possibilità che sono 
irrealizzabili con gli strumenti convenzionali. Sono una soluzione ideale per analizzatori genetici 
rapidi ed economici che permettono di consumare minime quantità di campioni, di avere brevi 
tempi di utilizzo e produttività elevata grazie alla parallelizzazione dei processi. La proteomica, che 
tratta l'identificazione e la caratterizzazione delle proteine, è diventata una delle aree di interesse 
biologico più studiate. I lab-on-a-chip possiedono le caratteristiche necessarie per 
un'implementazione di successo di dispositivi in grado di fornire analisi rapide ed efficienti del 
proteoma umano (Mouradian et al., 2002). Mediante sistemi microfluidici è stata ampiamente 
studiata anche la miniaturizzazione di colture cellulari (Hufnagel et al., 2009). La microfluidica ha 
dimostrato di poter offrire ambienti in vitro migliori rispetto alle tecniche tradizionali e la 
parallelizzazione ha permesso alte prestazioni su un singolo chip. I lab-on-a-chip sono utilizzati 
anche per lo studio e lo sviluppo di nuovi medicinali (Kang et al., 2008) e per il loro rilascio nei 
pazienti. Al di fuori del campo medico e biologico i lab-on-a-chip trovano applicazioni in 
optoelettronica, optoelettromeccanica e optofluidica (Psaltis et al., 2006). È possibile, ad esempio, 
integrare in un singolo chip un interferometro di Mach-Zender (Crespi et al., 2010) che rende 
possibili diversi esperimenti ed analisi sui liquidi presenti in microcanali. I lab-on-a-chip possono 
dunque essere utilizzati in molti ambiti di ricerca e il loro continuo sviluppo e perfezionamento 
consente di ottenere prestazioni sempre migliori.  
1.3 Materiali e metodi di fabbricazione 
Tra i vari materiali utilizzati per la fabbricazione dei dispositivi microfluidici c‟è il silicio, il più 
usato come substrato per i primi dispositivi data la grande disponibilità di tecniche di lavorazione 
mutuate dalla microelettronica, e il micromachining su di esso è stato ottimizzato nel corso degli 
anni. I vantaggi nell'utilizzo del silicio risiedono nelle sue buone proprietà meccaniche, 
nell'eccellente resistenza chimica e nella possibilità di integrare circuiti di controllo sul 
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