Preparazione di nanocompositi a base di rame-chitosano tramite ablazione laser e loro caratterizzazione analitica

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OBIETTIVI DEL LAVORO DI TESI 
 
Negli ultimi decenni è cresciuto l’interesse verso la produzione di materiali 
nanostrutturati che permettono di produrre coating capaci di conferire ai sistemi 
trattati proprietà idrofobe, idrofile, ignifughe, antibatteriche, per citarne alcune. 
In tal senso, nel gruppo di ricerca nel quale si è svolto questo lavoro di tesi si 
producono nanoparticelle di rame (CuNPs) tramite ablazione laser in liquido.  
Il primo obiettivo di questo lavoro è stato quello di preparare per la prima volta 
con tale tecnica nanocompositi a base di rame e di un biopolimero stabilizzante 
(chitosano). Per perseguire questo fine è stata utilizzata una procedura similare a 
quella utilizzata nel precedente lavoro di tesi svolto dal dottor Cacciapaglia, cioè 
l’ablazione laser di un target di rame con impulsi nel range dei femtosecondi in 
una soluzione acquosa acida contenente chitosano. Lo scopo è stato quello di 
produrre un materiale nanostrutturato che esplicasse un’azione antibatterica 
sinergica a carico di CuNPs e chitosano. Tali sistemi sono stati sottoposti a diverse 
caratterizzazioni spettroscopiche tipicamente effettuate su materiali 
nanostrutturati. Inoltre, essi sono stati anche depositati come film sottili a base di 
un polimero disperdente. Il comportamento dei nanocompositi proposti in questo 
lavoro verso specie microbiche è stato studiato mediante test biologici verso un 
batterio modello Gram-negativo sia in soluzione che sotto forma di film 
nanostrutturati. 
In aggiunta agli aspetti applicativi dei nanomateriali realizzati, si è valutato 
l’efficacia del protocollo di sintesi proposto. Infatti, tale approccio in batch è 
affetto da alcune limitazioni quali scarsa riproducibilità, limitata possibilità di 
ottimizzazione del processo e basse rese. Risulta, quindi, necessario proporre 
un’alternativa a tale setup sperimentale per cui il secondo obiettivo del presente 
lavoro è stato quello di mettere a punto un primo prototipo di sistema in flusso in 
modo da rendere il processo più riproducibile e controllato.
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CAPITOLO 1 
 
Introduzione 
 
1.1 Nanoparticelle 
Si definiscono nanoparticelle (NPs) aggregati di una qualsiasi natura chimica con 
dimensioni comprese, indicativamente, tra qualche nanometro e qualche 
centinaio di nanometro. Tutti gli aggregati compresi in questo range di 
dimensioni presentano delle proprietà comuni. Le NPs hanno un elevato 
rapporto superficie/volume; ciò significa che c’è una grande frazione di atomi 
superficiali. In Fig. 1 è rappresentato l’andamento dell’area della superficie delle 
nanoparticelle al variare del loro raggio. 
 
Figura 1. Superficie delle NPs al variare del raggio. Si osserva che quando il raggio delle NPs è dell’ordine dei 
nanometri, l’area superficiale è dell’ordine dei m
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. 
In generale nei materiali macroscopici succede che la superficie ha 
caratteristiche molto diverse dal bulk, poiché la presenza di legami insaturi 
all’interfaccia aria/materiale causa una maggiore reattività. Poiché le 
nanoparticelle hanno aree superficiali molto più estese, questo fenomeno è 
notevolmente amplificato, rendendo possibile tutta una serie di applicazioni non 
consentite per un materiale macroscopico
 
(1). Per esempio nanoparticelle d’oro 
possono essere utilizzate come catalizzatore in alcune reazioni
 
(2), mentre l’oro 
bulk è inerte; si possono utilizzare nel campo della sensoristica e biosensoristica,
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poiché l’elevata superficie a disposizione permette di progettare sensori molto 
sensibili e selettivi
 
(3)
 
(4); si possono utilizzare come sistemi di drug delivery per 
trasportare farmaci all’interno dell’organismo umano in modo da avere un 
rilascio controllato e mirato ad una zona stabilita (5). Altra caratteristica 
peculiare delle NPs è il cosiddetto confinamento quantico: le loro dimensioni 
sono confrontabili con la lunghezza d’onda di de Broglie dell’elettrone, quindi, 
come in una buca di potenziale, si avranno dei livelli energetici discreti, mentre 
nei solidi bulk i livelli energetici sono sovrapposti andando a formare delle bande. 
Inoltre, essendo il confinamento quantico un effetto molto sensibile alla 
dimensione delle particelle, ne deriva che le proprietà ottiche sono fortemente 
influenzate da forma, dimensione e ambiente circostante delle NPs
 
(6). La 
spettroscopia è, dunque, uno strumento molto potente per la caratterizzazione 
dei nanomateriali e la diagnostica del processo di produzione. Queste proprietà 
ottiche sono caratteristiche solo dei materiali nanostrutturati e hanno trovato 
applicazione nel campo delle energie rinnovabili
 
(7) Per esempio, AuNPs
 
(8) e 
ZnONPs
 
(9), sono state utilizzate nelle celle fotovoltaiche organiche per 
migliorare l’efficienza e l’assorbimento, e nella fabbricazione di semiconduttori 
luminescenti
 
(10). Le NPs presentano anche delle particolari proprietà 
magnetiche: molti materiali ferromagnetici, come la magnetite, se hanno 
dimensioni al di sotto di 20 nm possono diventare supermagnetici
 
(11) e possono 
essere utilizzati nell’ambito biomedico come mezzo terapeutico o come sonda 
per esami clinici, tra cui la risonanza magnetica nucleare
 
(12). Le NPs hanno 
anche spiccate proprietà antibatteriche, aspetto che verrà esaminato nel 
paragrafo successivo.
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1.2 Proprietà antibatteriche delle nanoparticelle 
Al giorno d’oggi è una sfida cruciale per la salute pubblica cercare nuovi metodi 
alternativi per contrastare infezioni da batteri, virus e funghi. Il largo uso di 
antibiotici ha permesso ad alcuni agenti patogeni di evolversi, riuscendo a 
sviluppare una certa resistenza e rendendo quindi i farmaci usati finora poco 
efficaci. Quindi, per combattere questi ultimi, bisogna utilizzare alte dosi di 
antibiotici, che risultano generalmente pericolose per la salute dell’uomo, oltre che 
svantaggiose economicamente (13). È stato dimostrato che le nanoparticelle hanno 
interessanti proprietà che permettono di combattere efficacemente vari agenti 
patogeni
 
(14). L’elevato rapporto superficie/volume delle nanoparticelle e la carica 
elettrostatica che trasportano sulla superficie sono fondamentali nel combattere i 
batteri, che spesso hanno una membrana cellulare carica elettrostaticamente e 
quindi l’interazione con le NPs è molto efficace. Gli effetti delle nanoparticelle 
dotate di bioattività posso essere distinti in battericidi (cioè capaci di uccidere i 
batteri) e batteriostatici (capaci di rallentare la proliferazione di colonie batteriche). 
L’efficacia delle nanoparticelle dipende, ovviamente, anche dal tipo di batterio 
considerato, dal tipo di nanoparticella utilizzata e dalle condizioni esterne
 
(13). 
Il tipo di membrana cellulare dei batteri, che è diversa nei batteri Gram-positivi o 
Gram-negativi, influisce molto sul ruolo delle nanoparticelle. A seconda della 
membrana, le NPs possono diffondere o meno all’interno, possono interagire o non 
interagire affatto, per cui la tolleranza dei batteri alle nanoparticelle e il tipo di 
interazione che si instaura cambiano notevolmente. Risulta, quindi, che alcune NPs 
sono più efficaci di altre su un batterio per cui bisogna operare una scelta oculata a 
seconda della situazione. Per esempio CuONPs sono più efficaci su E. Coli, che su S. 
Aureus, mentre vale la situazione contraria per ZnONPs (15). Alcuni batteri sono 
capaci di produrre un biofilm, uno strato che protegge la colonia batterica dagli 
antibiotici: l’interazione elettrostatica tra le NPs e il biofilm può portare alla 
distruzione dello strato protettivo del batterio, quindi lo si può combattere 
efficacemente. 
Queste proprietà sono molto importanti in vari ambiti, come l’industria tessile, il 
food packaging, la medicina, la disinfezione delle acque
 
(13).
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D’altro canto, poiché non sono ancora completamente noti gli effetti di biotossicità 
nonché l’impatto ambientale derivante dalle nanoparticelle, si deve esercitare un 
controllo attento sul loro impiego. A questo proposito negli ultimi anni sono 
aumentati gli studi riguardanti l’effetto delle nanoparticelle sull’ambiente e 
sull’uomo. Infatti, un uso eccessivo di nanoparticelle porterebbe alla distruzione dei 
batteri e dei microorganismi presenti nei terreni e nelle acque, utili alla 
decomposizione o al ciclo dell’azoto, causando un disastro ambientale irreversibile. 
In questo lavoro sono state prodotte nanoparticelle di rame tramite ablazione laser, 
in presenza di chitosano (CS). 
È noto, infatti, che le CuNPs, oltre ad avere proprietà adatte per essere utilizzate in 
molti ambiti, come catalizzatori, film conduttivi, lubrificazione
 
(16; 17; 18), hanno 
anche proprietà antimicrobiche contro un gran numero di microorganismi, come 
batteri, funghi, alghe e virus
 
(19; 20). Infatti, fin dall’antichità, gli Egizi, i Romani, gli 
Aztechi ed i Persiani hanno utilizzato il rame per sterilizzare l’acqua e per usi medici 
contro varie patologie. 
Il meccanismo con cui le NPs distruggono i batteri non è stato ancora ben 
compreso, ma si pensa che l’elevata reattività le peculiari proprietà fisico-chimiche 
causano gravi danni agli agenti microbici, in seguito a complesse reazioni redox che 
portano alla distruzione delle membrane cellulari, delle catene di DNA e RNA e delle 
proteine. 
D’altra parte, il chitosano è un polisaccaride lineare naturale che si ottiene per 
deacilazione della chitina. Esso, oltre ad essere non-citotossico, biocompatibile e 
biodegradabile, mostra spiccate proprietà antibatteriche (21) contro funghi, batteri 
Gram-positivi e Gram-negativi. 
La sua azione antibatterica è dovuta alle interazioni elettrostatiche che si instaurano 
tra il polimero e la membrana cellulare dei batteri. Questa interazione è influenzata 
da alcuni parametri esterni, come il pH della soluzione e la forza ionica, o interni, 
come il peso molecolare (MW) o il grado di deacilazione (deacetylation degree, DD) 
(22).
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Figura 2. Formula di struttura del Chitosano. 
A pH minore del pK
a
 del polimero (che vale circa 6.3) avviene la protonazione dei 
gruppi amminici. La carica positiva presente quindi sulla catena polimerica 
interagisce elettrostaticamente con la carica negativa della membrana cellulare dei 
batteri; è chiaro che a pH più bassi l’azione antibatterica è più efficace.L’azione del 
chitosano è tanto più forte quanto maggiore è il DD (23); ciò succede a pH acidi ed è 
quindi necessario utilizzare il chitosano a tale pH se si vuole sfruttare appieno la sua 
azione antimicrobica. È importante anche minimizzare la forza ionica della 
soluzione, poiché l’interazione di cationi metallici in soluzione con la membrana 
cellulare dei batteri va a indebolire l’effetto del chitosano. Il chitosano ha anche una 
grande capacità di formare complessi con cationi metallici, come Ag
+
 e Cu
2+
. La 
preparazione di CuNPs in presenza di CS dovrebbe consentire in seguito un’azione 
antimicrobica sinergica tra chitosano e nanoparticelle di rame, che potrebbe 
permettere di utilizzare delle concentrazioni molto basse dei due composti, rispetto 
a quando essi sono considerati singolarmente (24). Per avere un risultato ottimale 
bisogna considerare l’influenza del MW sul composito che si formerà. Con un basso 
peso molecolare del chitosano si ottiene una soluzione poco viscosa, che favorisce 
la coalescenza delle nanoparticelle a causa dell’Ostwald ripening, fenomeno tipico 
di un sistema colloidale in cui le particelle più piccole si dissolvono e vanno ad 
accrescere le particelle più grandi; con un alto peso molecolare si impedisce la 
diffusione delle nanoparticelle all’interno della matrice polimerica per cui viene 
prodotto un composito poco uniforme non molto efficace. Bisogna quindi ricercare 
un buon compromesso tra i suddetti parametri, in modo da impedire la 
coagulazione, ma non i moti diffusivi delle nanoparticelle.