Studio dell'espressione dei trasportatori kcc2 e nkcc1 durante lo sviluppo nel talamo murino

4 
 
RIASSUNTO 
 
Nel sistema nervoso centrale (SNC) il neurotrasmettitore GABA svolge un’azione 
inibitoria, mediata principalmente dall’attivazione di recettori ionotropici (GABA
A
) 
che consentono il passaggio dello ione cloruro. Nel SNC adulto la maggior parte dei 
neuroni ha una bassa concentrazione intracellulare di Cl
-
 che, in seguito all’apertura 
dei canali ionici, determina l’entrata di cloruro inducendo l’iperpolarizzazione della 
cellula. Nel SNC durante lo sviluppo, o in casi patologici, la concentrazione di Cl
- 
intracellulare viene mantenuta elevata, quindi viene favorita l’uscita dello ione 
determinando l’azione depolarizzante del GABA. Questo ‘switch’ funzionale ha un 
ruolo fondamentale nella crescita e nella formazione di circuiti neuronali 
nell’encefalo immaturo, ma alcuni aspetti di questo meccanismo rimangono ancora 
da chiarire. L’omeostasi neuronale della [Cl
-
]
i 
è determinata principalmente 
dall’azione di due cotrasportatori: KCC2 e NKCC1. KCC2 è un cotrasportatore 
accoppiato K
+
 e Cl
-
 che espelle ioni Cl
-
 dalla cellula; NKCC1 è un cotrasportatore 
Na
+
/K
+
/Cl
-
, che accumula ioni Cl
-
 all’interno della cellula. La transizione dell’effetto 
del GABA da eccitatorio a inibitorio dipende dalla progressiva variazione di 
espressione dei due cotrasportatori durante lo sviluppo. In diverse condizioni 
patologiche associate a ipereccitabilità come epilessia, schizofrenia e autismo, 
l'alterata espressione dei due trasportatori può contribuire ad alterare l'equilibrio tra 
eccitazione e inibizione, specialmente durante le fasi più precoci dello sviluppo 
neuronale postnatale. Sulla base di studi recenti, che hanno dimostrato come l’azione 
eccitatoria del GABA sia necessaria alla corretta maturazione neuronale, lo scopo di 
questo lavoro è stato lo studio comparativo dell’espressione di KCC2 e NKCC1 nel 
talamo murino a diversi stadi dello sviluppo postnatale e nell’adulto tramite tecniche 
biochimiche e immunocitochimiche. I risultati ottenuti mostrano che l’espressione dei 
due cotrasportatori subisce variazioni legate allo sviluppo con una generale maggior 
espressione alla nascita di KCC2 rispetto a NKCC1 che poi si modifica fino ad 
un’inversione dei livelli dei cotrasportatori nell’adulto. KCC2 è localizzato
5 
 
prevalentemente a livello del soma e dei dendriti delle sole cellule nervose, mentre 
NKCC1 risulta ubiquitario, sia neuronale che gliale, distribuendosi nel neurone sia 
nel compartimento somatodendritico, che in quello assonale e più raramente sinaptico. 
Entrambi i cotrasportatori non mostrano colocalizzazione con fibre V-GAT positive, 
mentre solo NKCC1 sembra essere espresso in sinapsi glutamatergiche durante lo 
sviluppo. Inoltre KCC2 mostra colocalizzazione con i recettori GABA
A
 
prevalentemente nelle fasi precoci dello sviluppo. Sia KCC2 che NKCC1 (sebbene 
quest’ultimo risulti distribuito più omogeneamente) risultano in generale 
maggiormente espressi nei nuclei ventrolaterali di relay rispetto ai nuclei della 
regione mediale. Particolare è la distribuzione nel nucleo reticolare che mostra scarsa 
espressione di KCC2 in tutte le fasi dello sviluppo postnatale e nell’età adulta.  
Concludendo i dati ottenuti indicano come l’espressione talamica precoce dei 
cotrasportatori, in particolare di KCC2, sia facilmente rapportabile allo sviluppo dei 
circuiti talamici che precedono il tardivo sviluppo del mantello corticale. Il 
successivo decremento solo di KCC2, in controtendenza rispetto ad altre aree 
cerebrali, potrebbe essere associato alla particolare organizzazione del sistema 
GABAergico nei nuclei talamici e alla eterogeneità delle sue afferenze. 
Il talamo è una delle strutture coinvolte nei fenomeni epilettogenici ed è per questo 
che si rende necessario chiarire il ruolo e l’espressione differenziale dei trasportatori 
del cloro in quest’area cerebrale. In particolare questo lavoro è preliminare ad uno 
studio che verrà intrapreso su un modello murino transgenico per una forma 
particolare di epilessia, l’epilessia notturna autosomica dominante del lobo frontale 
(ADNFLE). Il nostro lavoro ha fornito quindi dati preliminari utili per chiarire se nei 
pazienti affetti da ADNFLE lo squilibrio della componente eccitatoria possa essere 
dovuto ad alterazione del rapporto NKCC1/KCC2 e se questa alterazione possa 
influenzare l'effetto iperpolarizzante del GABA, contribuendo così all'insorgenza 
della patologia.
6 
 
1. INTRODUZIONE 
1.1  DEFINIZIONE E SVILUPPO DEL SISTEMA NERVOSO 
CENTRALE  
Il sistema nervoso centrale (SNC) o nevrasse è la 
porzione del sistema nervoso costituita 
dall’encefalo(contenuto nella scatola cranica) e dal 
midollo spinale  (contenuto nella colonna vertebrale). 
Un embrione di mammifero ha una struttura primaria 
trilaminare, costituita da endoderma, mesoderma ed 
ectoderma; la morfogenesi del Sistema Nervoso è un 
processo complesso che si svolge mediante la stessa 
sequenza di tappe in tutti gli embrioni dei vertebrati, 
nel quale intervengono due dei tre foglietti 
embrionali: il mesoderma e l’ectoderma; il primo 
induce cambiamenti morfologici nel secondo che può 
così differenziarsi fino a diventare tubo neurale. Nei 
roditori lo sviluppo embrionale si completa in circa 20-21 giorni; il sistema nervoso 
centrale (SNC) compare durante lo stadio di 
gestazione presomitico tardivo, tramite un 
processo chiamato neurulazione, mediante il 
quale la placca neurale, che è localizzata nella 
regione dorsale mediana davati al nodo di 
Hansen e alla linea primitiva, dà origine al 
tubo neurale. Durante questo processo  le 
cellule della placca neurale vengono indotte 
dalle cellule circostanti a proliferare, a 
invaginarsi e a staccarsi dalla superficie 
formando un tubo cavo (FIG. 1). A partire dall’undicesimo giorno di vita 
FIGURA 2. Suddivisione dell'encefalo 
embrionale nelle tre vescicole che daranno poi 
origine alle varie zone dell'encefalo stesso 
(medchrome.com) 
FIGURA 1. Sviluppo embrionale del 
sistema nervoso, nerulazione primaria. 
(university of Michigan.com)
7 
 
embrionale (E11), in cui si verifica la chiusura del tubo neurale, al giorno che 
precede la nascita è possibile osservare una serie di complesse trasformazioni che 
portano alla formazione del SNC ( Altman e Bayer, 1995;  Semba et al., 2004). 
Nel tubo neurale si possono distinguere: una porzione caudale allungata, da cui si 
originerà il midollo spinale, e una porzione cefalica allargata da dove si originerà 
l’encefalo. 
Inizialmente dalla porzione cefalica si differenziano le vescicole encefaliche 
primarie: proencefalo o encefalo anteriore, mesencefalo o encefalo mediano e 
romboencefalo o encefalo posteriore. La parete di tali vescicole è costituita di un 
semplice foglietto pseudostratificato di cellule neuroepiteliali dalle quali avranno 
origine tutte le strutture componenti il cervello maturo. Il processo che conduce un 
foglietto primordiale di cellule ad un cervello maturo può essere suddiviso in fasi 
discrete che sono state studiate in modo estensivo nel topo. La fase iniziale di tale 
processo comporta l’assegnazione di un’identità rostrocaudale (R-C) e dorso-ventrale 
(D-V) al tubo neurale (Beddington et al., 1998). R-C: La porzione proencefalica, che 
è quella di nostro interesse, si divide rapidamente nella vescicola telencefalica, da cui 
si svilupperà la corteccia cerebrale, i nuclei della base e i bulbi olfattivi, e nella 
vescicola diencefalica, che darà origine all’epitalamo, al talamo, al subtalamo e 
all’ipotalamo (FIG. 2). Anche il lume del tubo neurale si suddivide in quattro cavità: i 
ventricoli laterali (in corrispondenza del telencefalo), il terzo ventricolo (in 
corrispondenza del diencefalo), l’acquedotto (in corrispondenza del mesencefalo) e il 
quarto ventricolo (in corrispondenza del romboencefalo). D-V: Durante il suo 
sviluppo l’asse neurale si distingue in una metà dorsale denominata placca alare ed in 
una ventrale detta placca basale. In particolare, a livello del diencefalo la placca alare 
darà origine ai neuroni dei nuclei talamici, mentre la placca basale al primordio 
dell’ipotalamo (Altman e Bayer, 1995). 
Durante le prime fasi dello sviluppo embrionale il sistema nervoso è costituito quasi 
esclusivamente da cellule epiteliali proliferanti, che costituiscono il neuroepitelio, e 
che essendo sul contorno dei ventricoli formano la zona ventricolare. Oltre al
8 
 
neuroepitelio periventricolare primario, è presente una matrice germinale  secondaria, 
disposta esternamente alla zona ventricolare, che produce neuroni in alcune zone 
cerebrali come  a livello della corteccia cerebrale e cerebellare, e che viene chiamata 
zona subventricolare. Dal neuroepitelio inoltre deriveranno tutte le diverse strutture 
del SNC (Altman e Bayer, 1995). Il diencefalo, in particolare, deriva dalla 
proliferazione del neuroepitelio che contorna la cavità del terzo ventricolo. Il destino 
dei vari neuroni diencefalici è quindi determinato precocemente quando questi sono 
ancora in fase proliferante. I neuroblasti, precursori dei neuroni, iniziano a 
differenziarsi nel momento in cui perdono la capacità di dividersi, abbandonano il 
sito di proliferazione e migrano verso le sedi definitive di differenziamento. 
L’accurata organizzazione citoarchitettonica del SNC dipende proprio dalle capacità 
dei neuroni postmitotici di migrare seguendo appropriati segnali. È infatti proprio la 
migrazione che consente di generare l’architettura specifica di ogni regione cerebrale. 
Al momento della nascita (P0) l’organizzazione generale del sistema nervoso è ormai 
completata, ed è possibile individuare quasi tutte le strutture nervoso nella loro sede 
definitiva. Durante le prime fasi di vita postnatale l’encefalo subisce una ulteriore e 
definitiva maturazione basata non sull’aumento del numero degli elementi nervosi 
che lo costituiscono, ma sul differenziamento dei neuroni, sull’estensione dei 
prolungamenti neuritici e sulla loro successiva mielinizzazione. In particolare il 
processo di differenziamento, iniziato per alcuni tipi di neuroni già durante la vita 
embrionale, consiste nell’acquisizione di una specifica morfologia, di specifiche 
proprietà di membrana, nell’espressione di specifici neurotrasmettitori e nello 
sviluppo di appropriate e topograficamente definite connessioni con altre aree del 
sistema nervoso.