Il sistema adenosinico: principali targets molecolari ad attività anti-tumorale

CAPITOLO 1                                                                                        Adenosina e cancro 
 
 
 
CAPITOLO 1 
 
1.1 L’Adenosina  
L’adenosina (Ado) è un nucleoside purinico presente in vari tessuti e organi, 
coinvolto nella modulazione di diversi meccanismi omeostatici cellulari (sintesi degli acidi 
nucleici, metabolismo degli aminoacidi e regolazione del metabolismo cellulare) (Noji et 
al., 2004). Essa rappresenta inoltre un costituente importante di diverse molecole 
biologicamente rilevanti, soprattutto nei processi di tipo energetico, quali nicotinamide 
adenina dinucleotide (NAD), flavin adenin dinucleotide (FAD), coenzima A (Poulsen et al., 
1998). In condizioni patologiche (stress, dolore, ipossia, infiammazione) la produzione di 
questo autacoide subisce un incremento significativo a fronte di un’aumentata richiesta di 
energia a livello cellulare e quindi di una maggiore degradazione di adenosina trifosfato 
(ATP) (Cronstein, 1995; Latini Pedata, 2001). Per quanto riguarda la localizzazione 
cellulare della biosintesi dell’Ado, sono state descritte due vie principali: una 
principalmente in condizioni fisiologiche, si svolge a livello intracellulare attraverso l’azione 
della nucleotidasi S-adenosilomocisteina (SAH) (Fig.1A); l’altra, in condizioni patologiche, 
prevede la degradazione sequenziale a livello extracellulare di ATP ad ADP e 
successivamente ad AMP, mediante l’azione dell’apirasi CD39, per terminare con la 
produzione di Ado ad opera dell’enzima ecto-5’-nucleotidasi CD73, considerato l’enzima 
limitante dell’intero processo biosintetico (Latini and Pedata, 2001) (Fig.1B). Questa via 
biosintetica è utilizzata quando il fabbisogno energetico cellulare risulta aumentato ma 
non adeguatamente sostenuto da un incremento delle disponibilità di ossigeno come ad 
esempio nei processi infiammatori.  
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
Fig.1 Biosintesi e metabolismo dell’Ado. Sintesi dell’Ado in condizioni fisiologiche (A) e patologiche 
(B).  
 
 
 
 
A 
B
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1.2 Meccanismi di trasporto dell’adenosina 
Il trasporto dell’Ado attraverso le membrane cellulari avviene per mezzo di carrier 
nucleosidici, i quali svolgono un ruolo importante nella regolazione dei livelli extracellulari 
di quest’autacoide (Cass et al., 1999; Cabrita et al., 2002). I trasportatori nucleosidici sono 
classificati in base alle loro caratteristiche funzionali e alla loro struttura molecolare in due 
principali categorie: 1) trasportatori nucleosidici equilibrativi; 2) trasportatori nucleosidici 
concentrativi (Cass et al., 1998; Casado et al., 2002).  
I trasportatori nucleosidici equilibrativi (ENT) agiscono attraverso meccanismi di 
trasporto passivo e di diffusione facilitata. Essi facilitano il flusso di nucleosidi attraverso le 
membrane cellulari sfruttando il gradiente di concentrazione dell’Ado nel compartimento 
intra ed extracellulare. I trasportatori equilibrativi sono presenti in vari tessuti (cervello, 
fegato, pancreas, intestino, cuore, timo, polmone, milza, rene, muscolo scheletrico) e 
partecipano alla regolazione di diverse funzioni fisiologiche (Fig.2).  
Attualmente sono stati identificati 4 tipi di trasportatori equilibrativi (ENT1, ENT2, ENT3 e 
ENT4) (Podgorska et al., 2005). I trasportatori nucleosidici equilibrativi vengono classificati 
sulla base della loro diversa sensibilità all’inibizione da parte dell’analogo nucleosidico 
nitrobenziltioinosina (NBTI) (Yao et al., 1997; Hyde et al., 2001). Si distinguono infatti in: 
a) trasportatori equilibrativi-sensibili (es), potentemente inibiti a concentrazioni nanomolari 
di NBTI (ENT1 e ENT3); b) trasportatori equilibrativi-insensibili (ei) bloccati solo in 
presenza di concentrazioni micromolari di NBTI (ENT2) (Buolamwini, 1997). Le 
caratteristiche del trasportatore ENT4, di recente identificazione, non sono state per il 
momento determinate (Podgorska et al., 2005). 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
Fig.2 Rappresentazione schematica di un trasportatore per nucleosidi del tipo equilibrativo (ENT) 
 
I trasportatori nucleosidici concentrativi (CNT) (Fig.3) promuovono il flusso di 
nucleosidi all’interno delle cellule contro gradiente di concentrazione attraverso 
meccanismi di trasporto attivo sodio-dipendenti. I trasportatori nucleosidici concentrativi 
sono suddivisi in tre sottotipi (CNT1, CNT2, CNT3), in base alla loro selettività nei 
confronti di diversi substrati (Wang et al., 1997; Ritzel et al., 2001). I trasportatori CNT1 
trasportano selettivamente le pirimidine, ma hanno la capacità di legare anche le purine. 
Questi trasportatori rappresentano un bersaglio per vari farmaci antivirali (zidovudina, 
lamivudina) e per alcuni farmaci ad attività antineoplastica (citarabina, gemcitabina).  
I trasportatori CNT2 sono implicati nel trasporto di nucleosidi a struttura purinica. Farmaci 
antivirali quali didanosina e ribavirina sfruttano questo sistema di trasporto per penetrare
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all’interno della cellula e svolgere la propria attività farmacologica (Gray et al., 2004). La 
maggior parte degli studi condotti sui trasportatori nucleosidici si è concentrata sul 
sottotipo es poiché questi sono ampiamente espressi in molti distretti dell’organismo, dove 
partecipano alla regolazione di numerose funzioni fisiologiche (Noji et al., 2004). 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
Fig.3 Rappresentazione schematica di un trasportatore per nucleosidi di tipo concentrativo (CNT) 
 
1.3 I recettori dell’adenosina 
I recettori per l’Ado sono di tipo metabotropico ovvero monomeri molecolari costituiti 
da una singola catena peptidica che attraversa la membrana cellulare sette volte, 
interagendo, nello spazio citoplasmatico, con una proteina G. Nel 1978 Burnstock propose 
l’esistenza di almeno due tipi di recettori per le purine, denominati P1 e P2. La sigla P1 
identifica la famiglia di recettori maggiormente sensibili ad Ado, mentre i recettori P2 sono 
preferenzialmente attivati da ATP e ADP (Burnstock, 1978). L’antagonismo funzionale tra 
ATP e Ado è molto interessante, in quanto l’ATP, presente nelle terminazioni sinaptiche e 
parasinaptiche, genera Ado. L’ATP induce attività rapide e transitorie di tipo eccitatorio, 
mentre l’Ado evoca effetti lenti e inibitori. L’Ado regola quindi con un meccanismo di 
feedback inibitore sia le attività eccitatrici dell’ATP, che quelle di neurotrasmettitori co-
liberati con ATP dai terminali nervosi. Questa complessa regolazione suggerisce che piø 
elevato è il grado di attivazione iniziale, e quindi maggiore è la liberazione di ATP, 
maggiore sarà il controllo inibitore esercitato dall’Ado, in quanto maggiore sarà la quantità 
di nucleoside che si forma a partire dall’ATP (Sawynok, 2007). Un ulteriore criterio di 
differenziazione tra recettori P1 e P2 è basato sulla diversa sensibilità agli antagonisti di 
tipo xantinico: infatti i recettori P1 sono inibiti competitivamente da farmaci xantinici quali 
caffeina, teofillina e teobromina, che sono inattivi sui recettori P2. Questa suddivisione 
generale in recettori P1 e P2 ha rappresentato la base per l’attuale classificazione e 
nomenclatura di questi recettori. Ciascuna delle due famiglie comprende diversi sottotipi 
recettoriali identificabili in base al profilo farmacologico, al meccanismo di traduzione del 
segnale e alla struttura molecolare (Fredholm et al., 2001).  
L’Ado può interagire con 4 sottotipi recettoriali (P1) localizzati a livello della 
membrana citoplasmatica (A
1
, A
2A
, A
2B
, A
3
) e che hanno una distribuzione variabile in 
diversi sistemi (sistema nervoso centrale, cardiovascolare, renale, respiratorio, 
immunitario e gastrointestinale) dove partecipano alla modulazione delle normali funzioni 
biologiche (Ralevic and Burnstock, 1998).
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In passato, i recettori dell’Ado sono stati classificati in base alla loro struttura 
molecolare, al loro profilo farmacologico e al loro meccanismo di trasduzione del segnale 
(Fredholm et al., 2001). Ciascun sottotipo è accoppiato ad un determinato tipo di proteina 
G, che può essere stimolatrice (Gs) o inibitrice (Gi) La stimolazione di questi recettori può 
determinare l’attivazione o l’inibizione dell’adenilato ciclasi, rispettivamente. Inoltre, in 
alcuni tessuti, i recettori A
1 
e A
3 
sono capaci di modulare l’attività della fosfolipasi C e, nel 
caso del recettore A
1
, di canali ionici per il Ca
2+ 
o K
+ 
 (Fredholm et al., 2001). 
 
1.3.1 Recettore A
1 
Ampiamente espresso in tutti i distretti dell’organismo, il recettore A
1
 presenta la 
sua massima espressione a livello cerebrale, spinale, cardiaco e adiposo (Ciruela et al., 
2010). Attraverso l’interazione con questo recettore, l’Ado regola diverse funzioni 
fisiologiche tra cui gittata cardiaca, filtrazione glomerulare, rilascio di renina e lipolisi 
(Elzein and Zablocko 2008). Il recettore A
1
 è un recettore accoppiato a proteina G
i
 la cui 
attivazione comporta una rapida diminuzione dei livelli di cAMP intracellulari, attraverso 
l’inibizione dell’adenilato-ciclasi. Tuttavia ulteriori studi hanno evidenziato diverse 
pathways associate all’attività di questo recettore tra cui l’attivazione di canali per il 
potassio, l’inattivazione di canali per il calcio (di tipo N, P e Q), l’attivazione della 
fosfolipasi C e la regolazione di diverse chinasi mitogene (Fredholm et al., 2001). Infatti 
alcuni autori hanno dimostrato che la stimolazione del recettore A
1
 transientemente 
espresso in cellule COS-7, determina l’attivazione della chinasi mitogena ERK1/2 
attraverso la mobilizzazione della subunità bg di una proteina G
i
. Successivi studi effettuati 
su cellule CHO dimostrano inoltre, che lo stato di fosforilazione di ERK1/2 può essere 
direttamente correlato alla pathway dell’asse PI3K-Akt (Schulte and Fredholm, 2000; 
Dickenson et al., 1998). (Fig.4)  
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
Fig.4 Rappresentazione schematica del recettore A1 con le sue principali signaling pathways
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1.3.2 Recettore A
2A
 
Questo sottotipo recettoriale è stato identificato insieme al sottotipo A
2B 
nei mastociti 
presenti nel fluido broncoalveolare umano, e per questo è stato ipotizzato un suo ruolo 
importante nella patogenesi dell’asma e della broncopneumopatia cronica ostruttiva 
(BPCO) (Polosa et al., 2002). La trasduzione del segnale avviene attraverso una proteina 
G
s 
(Klinger et al., 2002). L’effettore coinvolto è l’adenilato ciclasi (Fredholm et al., 2001). 
L’identificazione e la caratterizzazione di ligandi potenti e selettivi per il recettore A
2A 
ha 
permesso un’analisi delle diverse risposte funzionali indotte dall’attivazione o 
dall’inibizione del recettore e, di conseguenza, è stata compresa la sua importanza 
biologica in condizioni sia fisiologiche che patologiche, quali ischemia/ipossia, 
infiammazione e cancro (Pedata et al., 2005). Anche l’attivazione del recettore A
2A
 
determina un aumento dell’attività di ERK1/2. Infatti agonisti selettivi-A
2A
 esercitano effeti 
mitogeni sulle cellule endoteliali attraverso l’attivazione della signaling pathway cAMP-ras-
MEK1 (Sexl et al., 1997). Tuttavia le signaling pathways utilizzate da questo recettore di 
pendono dal background molecolare e dal network di segnali cellulari che 
contraddistingue il tipo di cellula. Infatti in molti casi ad esempio, l’attivazione di ERK1/2 
non dipende dall’asse G
s
-cAMP-PKA, ma dalla PKC. Inoltre in alcuni casi l’attivazione del 
recettore A
2A
 non aumenta lo stato di fosforilazione di ERK, ma bensì lo riduce (Seidel et 
al., 1999) (Fig.5). 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
Fig.5 Rappresentazione schematica del recettore A 2A con le sue principali signaling pathways
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1.3.3 Recettore A
2B
 
I recettori A
2B 
sono stati clonati dall’ipotalamo di ratto (Rivkees e Reppert, 1992), 
dall’ippocampo umano (Pierce et al., 1992) e dai mastociti di topo (Marquardt et al., 1994), 
utilizzando la tecnica di polymerase chain reaction (PCR). La trasduzione del segnale 
avviene attraverso una proteina G
s 
che induce un aumento dei livelli di cAMP e 
successiva attivazione di proteinchinasi (Polosa, 2002). Il recettore A
2B 
possiede inoltre la 
capacità di aumentare i livelli di IP
3
, suggerendo un accoppiamento anche con una 
proteina di tipo G
q
, e determinando quindi la liberazione degli ioni calcio dai depositi 
cellulari (Klinger et al., 2002). Tuttavia, il recettore A
2B
 è il solo sottotipo adenosinico 
capace di attivare non solo ERK1/2, ma anche le chinasi mitogene JNK e p38 (Feoktistov 
et al.,1999) (Fig.6). 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
Fig.6 Rappresentazione schematica del recettore A 2B con le sue principali signaling pathways
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1.3.4 Recettore A
3
 
I recettori A
3 
sono stati identificati nel ratto a livello di reni, tessuto cardiaco, 
cervello, polmone e testicoli. Nell’uomo i recettori A
3 
sono presenti a livello di fegato, 
placenta, reni, cervello, aorta, cuore, polmoni, testicoli e tratto gastrointestinale (Fredholm 
et al., 2001). Questo sottotipo recettoriale presenta un meccanismo di trasduzione 
analogo a quello dei recettori A
1
, dove la proteina G è di tipo inibitore, ed ha quindi la 
capacità di bloccare l’attività dell’adenilato ciclasi riducendo i livelli di AMPc. Tuttavia, 
questa non sembra essere l’unica via di trasduzione, poiché é stato dimostrato che anche 
un incremento dei livelli di IP
3
, con conseguente attivazione dei canali al calcio, attraverso 
l’attivazione di una proteina G
q
 (Poulsen et al., 1998). Analogamente agli altri recettori 
anche il recettore A
3
 è in grado di attivare direttamente ERK1/2, anche se, come per tutti i 
recettori adenosinici, i suoi effetti dipendono dal tipo cellulare e dallo stato di 
differenziazione, e dai livelli di espressione di tutti i recettori (Fig.7). 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
Fig.7 Rappresentazione schematica del recettore A 3 con le sue principali signaling pathways