Subproteomi delle membrane mitocondriali di muscolo cardiaco bovino: nuove metodologie di isolamento

Introduzione   
1 
 
 
 
 
 
 
INTRODUZIONE  
 
 
Le proteine integrali di membrana presiedono a gran parte dei processi biologici e 
costituiscono il bersaglio di una notevole quantità di farmaci. L’impiego di diverse 
strategie biochimiche, biofisiche e di biologia molecolare hanno fornito informazioni 
complementari, preziose per identificare e caratterizzare un numero elevato di proteine 
di membrana, limitando però le conoscenze strutturali. Ad oggi, la cristallizzazione di 
proteine integrali di membrana risulta essere estremamente difficoltosa, a causa della 
disponibilità, generalmente limitata, di materiale proteico di partenza, che rende 
impraticabile una purificazione diretta dai tessuti. Ulteriori limiti sono rappresentati 
dall’elevata tendenza all’aggregazione e dalla natura idrofobica di queste proteine, 
fattori che influenzano fortemente la solubilità e quindi condizionano la scelta di 
adeguati detergenti. Questi ultimi rivestono un ruolo fondamentale nell’isolamento e 
nella purificazione delle proteine dai tessuti, poichè ne permettono la solubilizzazione. 
Lo step di solubilizzazione di questo tipo di proteine porta alla destabilizzazione della 
componente lipidica di membrana, con formazione di frammenti lipidici, frammenti di 
membrana e di proteina. La solubilizzazione e la successiva incorporazione di proteine 
di membrana aventi funzione di trasporto (carriers) all’interno di vescicole 
fosfolipidiche (dette liposomi) permette di purificare e caratterizzare funzionalmente 
questo tipo di proteine seguendone l’attività di trasporto. A tale scopo, dopo ogni step di 
purificazione, viene misurata la concentrazione proteica totale e l’attività di trasporto 
del carrier d’interesse, per valutare il grado di arricchimento proteico delle varie frazioni 
purificate. Tali metodi seppur sensibili, non permettono nè di effettuare 
un’identificazione non ambigua ed univoca della proteina d’interesse, né di 
caratterizzarla strutturalmente.  
L’analisi e caratterizzazione di proteine di membrana mediante approccio proteomico 
rappresenta oggi un importante obiettivo della proteomica, poiché esse costituiscono il
Introduzione   
2 
 
20-30% del genoma eucariotico.
1]
 L’isolamento e la purificazione di tali proteine risulta 
però notevolmente difficile, poichè questo genere di proteine risulta scarsamente 
rilevabile tramite l’impiego dell’elettroforesi 2-D. Infatti, la ridotta presenza di proteine 
integrali di membrana nei proteomi di estratti cellulari totali è ascrivibile ad una loro 
scarsa abbondanza cellulare rispetto alle proteine solubili, certamente più rappresentate; 
per ovviare ad un simile problema è generalmente necessario ricorrere al frazionamento 
subcellulare ed alla successiva analisi delle singole frazioni. Un altro fattore che ne 
complica la caratterizzazione riguarda i punti isoelettrici, generalmente alcalini, 
rendendo queste proteine scarsamente evidenziabili su un gel 2-DE standard. Inoltre, 
questo tipo di proteine risulta scarsamente solubile nei buffer acquosi utilizzati 
ordinariamente nella IEF. La solubilità delle proteine integrali di membrana e la scelta 
del detergente opportuno per ottenerne la completa solubilizzazione, rappresentano gli 
aspetti cruciali per la loro completa caratterizzazione attraverso l’uso dell’approccio 
proteomico. 
Scopo di questo lavoro è stato quello di testare differenti strategie di frazionamento 
subcellulare, d’estrazione, di solubilizzazione e di purificazione di proteine integrali di 
membrana, da mitocondri di muscolo cardiaco bovino, utili alla completa 
caratterizzazione strutturale delle proteine d’interesse mediante metodologie 
proteomiche. Il subproteoma delle membrane mitocondriali di muscolo cardiaco bovino 
è stato quindi sottoposto a frazionamento chimico, allo scopo di ottenere frazioni 
semplificate di proteine e spots elettroforetici definiti, impiegati per l’identificazione e 
la caratterizzazione delle proteine d’interesse mediante spettrometria di massa MALDI 
MS e MS/MS. Tale approccio ha permesso l’identificazione di due trasportatori della 
membrana mitocondriale interna: il carrier del 2-chetoglutarato e l’ isoforma del carrier 
dei nucleotidi adeninici: AAC1, inoltre, sono state identificate due isoforme della 
proteina di membrana mitocondriale esterna denominata porina o Voltage-Dependent 
Anion Channel (VDAC1 e VDAC2).
Capitolo 1  
3 
 
 
 
 
CAPITOLO 1 
MITOCONDRI E PROTEINE DI MEMBRANA 
 
 
1.1 I Mitocondri. 
 
I mitocondri sono organuli costantemente presenti nel citoplasma di tutte le cellule 
animali e vegetali a metabolismo aerobio. Essi sono gli organuli citoplasmatici più tipici 
e caratterizzano in modo specifico le cellule. Questi organuli sono assenti nelle cellule 
procariotiche, cioè i batteri, dove le funzioni respiratorie vengono espletate da proteine 
enzimatiche localizzate nella membrana cellulare e nelle sue invaginazioni, dette 
mesosomi. 
I mitocondri hanno una morfologia che varia a seconda dello stato funzionale in cui 
si trovano e, proprio per questo, in passato sono stati variamente classificati: mitocondri 
(forme granulari), condrioconti (forme filamentose) e condriomiti (forme a bastoncino). 
Oggi, tali organuli vengono chiamati indifferentemente mitocondri. Col termine di 
condrioma s’intende generalmente la dotazione mitocondriale di una cellula. 
Nella maggior parte delle cellule si presentano come bastoncini del diametro di 0,2÷1 
m e possono raggiungere una lunghezza massima di 10 m. Tuttavia, la forma dipende 
dall’attività cellulare, in quanto i mitocondri modificano le loro dimensioni durante il 
ciclo secretorio, durante il quale possono presentare uno spessore maggiore, con un 
diametro compreso tra  0,2  2 m. 
I mitocondri reagiscono immediatamente alle variazioni di pressione osmotica, 
rigonfiandosi in ambiente ipotonico e raggrinzendosi in soluzioni ipertoniche. Sono 
organuli molto dinamici, infatti passano rapidamente dalla forma granulare a quella 
filamentosa nonché a quella bastoncellare, possono allungarsi e restringersi, accorciarsi 
e rigonfiarsi, mostrando una notevole contrattilità, sono inoltre capaci di rapidi 
movimenti e di rapide trasformazioni: un mitocondrio semplice può biforcarsi e 
frammentarsi,  due mitocondri possono fondersi in uno.
Capitolo 1  
4 
 
Da un punto di vista funzionale, i mitocondri rappresentano la centrale energetica 
della cellula, in quanto immagazzinano, sotto forma di ATP o adenosintrifosfato, 
l’energia liberata nel corso delle reazioni metaboliche, che successivamente è resa 
disponibile per le attività cellulari. 
La localizzazione dei mitocondri dipende dalla funzione che la cellula svolge, 
essendo prevalentemente distribuiti in quelle aree in cui la cellula necessita di maggiore 
energia. Nel muscolo si trovano di fronte ai dischi A delle miofibrille, nei bastoncelli 
della retina occupano il segmento interno, nella regione basale della cellula tubulare 
renale producono l’energia che la membrana utilizza per il trasporto dell’acqua e delle 
altre molecole. 
Il numero di mitocondri per cellula è variabile, essendo in relazione al fabbisogno 
energetico: mentre in una normale cellula si trovano da 1.000 a 2.000 mitocondri, 
nell’oocita di alcune specie animali essi possono aumentare fino ad un valore di 30.000. 
Si ritiene che nella cellula epatica i mitocondri costituiscano dal 30 al 35% delle 
proteine cellulari totali.  
 
 
 
Figura 1: Rappresentazione tridimensionale e strutturale dei mitocondri. 
 
I mitocondri risultano essere separati dall’ambiente citoplasmatico mediante un 
sistema di membrane aventi caratteristiche diverse rispetto alle altre membrane cellulari. 
Essi sono delimitati da due membrane, una più interna e l’altra più esterna, separate 
tra loro da uno spazio, definito come spazio intermembrana.
Capitolo 1  
5 
 
Dal punto di vista strettamente strutturale queste membrane sono elastiche, flessibili 
e stabili. Procedendo dall’esterno, troviamo in successione:  
- la membrana mitocondriale esterna, a struttura trilaminare, formata da proteine 
intrinseche globulari (3.500-4.000 per m²); tali proteine rappresentano il 60% 
della membrana esterna e sono localizzate nello spessore dello strato lipidico, che 
a sua volta rappresenta il 40%. Le proteine integrali, dette porine, costituiscono 
dei pori atti a facilitare il passaggio bidirezionale di metaboliti con peso 
molecolare inferiore a 10.000 Da. La permeabilità della membrana esterna fa sì 
che la composizione biochimica dello spazio intermembrana sia simile a quella 
del citoplasma. Questa membrana contiene numerosi enzimi: alcune transferasi e 
chinasi, ATP acetil-CoA sintetasi, citocromo b, NADH, citocromo b reduttasi, ed 
enzimi responsabili dall’ossidazione dell'adrenalina, dell'allungamento degli acidi 
grassi e della degradazione del triptofano. 
- lo spazio intermembrana. 
- la membrana mitocondriale interna, che si estende nella matrice mitocondriale, 
formando delle pieghe dette creste mitocondriali, la cui organizzazione 
molecolare è completamente diversa da quella esterna. Non solo essa presenta una 
particolare ricchezza in proteine (80%) ed una relativa povertà in lipidi (20%), ma 
possiede una sua tipica organizzazione molecolare. In particolare, questa 
membrana è costituita da un doppio strato lipidico ed è completamente 
impermeabile a tutti i composti tranne che a CO
2
, O
2
 e H
2
O. Essa è priva di 
colesterolo e ricca di cardiolipina (difosfatidil-glicerolo), un lipide il cui nome è 
dovuto al fatto che fu scoperto per la prima volta nelle cellule cardiache.La 
cardiolipina è responsabile della forte impermeabilità della membrana interna ai 
protoni, inoltre le conferisce una elevata fluidità. La membrana mitocondriale 
interna contiene proteine intrinseche e particelle elementari extramembranarie 
(evidenziabili impiegando colorazioni negative) collegate a proteine intrinseche 
per mezzo di un peduncolo, essa contiene anche gli enzimi responsabili delle 
reazioni di ossidazione che liberano l’energia necessaria alla fosforilazione 
ossidativa, cioè alla formazione di ATP a partire da ADP. 
- la camera interna, o matrice mitocondriale, rappresenta lo spazio delimitato dalle 
creste della membrana interna. La matrice è finemente granulare e la sua densità e 
composizione variano in relazione allo stato funzionale dell’organello; si
Capitolo 1  
6 
 
riscontrano costantemente: molecole di DNA (detto mtDNA), mitoribosomi, o 
mtRNA, visibili dopo colorazioni negative e granulazioni dense, irregolari, con 
diametro di 50 nm (imputabili ad un accumulo di cationi). La matrice contiene 
inoltre tutti gli enzimi coinvolti nel ciclo di Krebs e quelli responsabili della 
biosintesi degli acidi grassi. 
 
Le creste mitocondriali sono invaginazioni della membrana interna a forma di tubuli 
o di sacculi che penetrano in profondità nella matrice mitocondriale. Non si conosce  
molto bene come tali creste siano adese né la loro morfologia, anche se vengono 
rappresentate nelle seguenti fogge: 
- sotto forma di bottiglie piatte oppure di fiaschi, il cui collo, o peduncolo, sarebbe 
più stretto della cresta stessa;  
- sotto forma di sacculi, le cui pareti, senza strozzature, si continuano con la 
membrana interna. Contrariamente al caso precedente, il compartimento interno 
della cresta comunica liberamente con la camera esterna, e non attraverso uno 
stretto orifizio; 
- sotto forma di tubuli.  
 
Alle creste mitocondriali aderiscono, addensati sotto forma di pacchetti granulari, 
numerosi enzimi sia della catena respiratoria sia preposti alla sintesi dell'ATP. 
Per quanto riguarda l’origine dei mitocondri è possibile che tali organelli 
citoplasmatici si siano evoluti dai batteri procariotici aerobici, che vivevano in simbiosi 
con cellule ospiti eucariotiche anaerobiche. Secondo questa teoria, detta “Ipotesi degli 
endosimbionti”, le cellule eucariotiche per adttarsi alle nuove condizioni dell’ambiente 
circostante, che piano piano era diventato aerobio per la comparsa dei cianobatteri 
fotosintetici, avrebbero fagocitato i batteri aerobici per stabilire una relazione 
simbiontica permanente. L’ospite fornì agli endosimbionti le sostanze nutritizie e la 
protezione, mentre gli endosimbionti fornivano all’ospite anaerobico la respirazione 
aerobica più efficiente sotto il profilo energetico.
 [2]
 
Negli ultimi anni è stato dimostrato che il mitocondrio possiede un proprio 
patrimonio genetico, distinto da quello del resto della cellula. In termini di eredità 
genetica, il DNA mitocondriale viene ereditato esclusivamente dalla madre, ogni 
individuo entro una determinata linea materna avrà lo stesso DNA mitocondriale. Il
Capitolo 1  
7 
 
DNA mitocondriale umano consiste di 5-10 molecole circolari di DNA, organizzate in 
raggruppamenti distinti nella matrice del mitocondrio, ancorate alla membrana interna. 
Esso  consta di 16569 paia di basi e 37 geni (codificanti per 13 proteine, 22 tRNA e 2 
rRNA), coinvolti nella produzione di proteine necessarie alla respirazione cellulare. 
Molte proteine presenti nei mitocondri sono codificate dal DNA nucleare: si ritiene che 
alcune di esse, anche se non molte, facessero originariamente parte del mtDNA e  che 
durante l'evoluzione siano state trasferite nel nucleo. Il DNA mitocondriale accumula 
mutazioni più rapidamente del DNA nucleare, a causa di un elevato numero di 
replicazioni e dall’assenza degli istoni e di meccanismi di riparazione. 
I mitocondri sono il principale bersaglio dei processi di invecchiamento, tendono ad 
accumulare delezioni e mutazioni puntiformi, che portano ad un cambiamento della 
morfologia e della funzionalità mitocondriale. L’invecchiamento e la perdita di 
efficienza del mitocondrio compromettono la produzione energetica e spesso conducono 
alla morte del tessuto. E’ stato ipotizzato che una semplice mutazione genetica dei 
mitocondri potrebbe essere alla base di tutta una serie di gravi malattie metaboliche 
come: l’ipertensione arteriosa, 
3] 
l’ipercolesterolemia, l’obesità ed il diabete. 
 
 
1.2 Proteine di trasporto mitocondriali. 
 
Il mitocondrio, per poter svolgere le sue funzioni, deve essere in comunicazione con 
il citosol attraverso lo scambio di una grande varietà di metaboliti. Questa 
comunicazione è indispensabile, in quanto molti processi fisiologici richiedono la 
partecipazione di reazioni enzimatiche sia intra che extramitocondriali; inoltre, essa è 
utile per assicurare un equilibrio tra la composizione del citosol e quella della matrice 
mitocondriale. Molecole trasportate verso la matrice mitocondriale sono: amminoacidi, 
acidi grassi, cationi piruvato, prodotti intermedi del ciclo dell'acido citrico, ADP e 
fosfato inorganico. Diversi sono i metaboliti esportati dalla matrice mitocondriale verso 
il citosol: aspartato, citrullina, citrato, 2-chetoglutarato, carnitina ed ATP, ossia il 
composto ad alta energia richiesto dalla stragrande maggioranza delle reazioni 
metaboliche endoergoniche. La membrana mitocondriale esterna non pone un limite al 
passaggio di questi composti, grazie alla presenza delle porine, mentre quella interna 
risulta di per sé completamente impermeabile.