Studio dell’evoluzione di Listeria monocytogenes in prodotti di gastronomia mediante Microbial Challenge Test

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Introduzione 
 
La legislazione comunitaria in materia di alimenti negli ultimi anni ha subito 
notevoli cambiamenti, in particolar modo dopo la pubblicazione del Libro Bianco 
(12 gennaio 2000) che ha portato l’attenzione sulla necessità di garantire in tutta 
Europa elevati standard di sicurezza mediante un impianto normativo solido e 
immediatamente condiviso fra tutti gli stati membri dell’Unione Europea. 
Per garantire il raggiungimento degli obiettivi di sicurezza vengono individuati 
alcuni principi come:  
- responsabilità degli operatori del settore alimentare nel settore 
agroalimentare per l’applicazione di misure idonee ad ottenere alimenti 
sani e salubri; 
- controllo di filiera e rintracciabilità garantita dai campi alla tavola; 
- nuove metodologie per il controllo ufficiale; 
- individuazione di criteri microbiologici (di processo e di sicurezza) che 
consentano di verificare la corretta applicazione dei regolamenti igienico 
sanitari, con attenzione in modo particolare, a quegli alimenti e a quei 
microrganismi che costituiscono oggi, anche dal punto di vista 
microbiologico, un serio problema per la salute pubblica.  
Tra questi vi è certamente Listeria monocytogenes, agente della listeriosi,  
una delle più importanti malattie alimentari degli ultimi decenni 
(Mereghetti et al., 2002). 
Questo batterio è un bacillo gram-positivo psicrotrofo caratterizzato da una forte 
capacità di adattamento a condizioni stressanti che gli consente di sopravvivere e 
replicare negli alimenti e nell’ambiente (Tauxe, 1997). 
L’epidemiologia della listeriosi non è, tuttavia, solamente legata alle 
caratteristiche di ubiquitarietà, resistenza, capacità di crescita in biofilm etc.. 
tipiche del microrganismo. I mutamenti della vita sociale (specialmente dei paesi 
industrializzati) e, di conseguenza, le nuove abitudini dei consumatori, sembrano 
aver favorito un aumento dell’incidenza di questa malattia.
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Tra i fattori sociali da tenere in forte considerazione spiccano sicuramente: 
- la diffusione del virus dell’HIV, 
- l’applicazione di trattamenti immunosoppressivi nella terapia dei tumori e 
nei trapianti d’organo, 
- le modificazioni nella produzione (ampia applicazione di “Mild 
technologies”  ovvero tecnologie poco aggressive nei confronti dei 
microrganismi e in grado di mantenere le caratteristiche organolettiche 
naturali dell’alimento) e conservazione degli alimenti con grande 
prolungamento della shelf-life media degli stessi (Farber et al., 1991), 
- i cambiamenti delle abitudini alimentari dei consumatori che hanno 
provocato  un forte incremento della richiesta di cibi pronti al consumo 
(Ready To Eat). 
 
Gli alimenti RTE sono stati fortemente apprezzati dal consumatore che, in questi, 
ricerca i caratteri di: freschezza, rapidità di impiego, praticità e facile utilizzo.  
Per alimenti RTE si intendono, secondo quanto afferma il Regolamento CE 
2073/2005, “..prodotti alimentari destinati dal produttore o dal fabbricante al 
consumo umano diretto, senza che sia necessaria la cottura o altro trattamento 
per eliminare o ridurre a un livello accettabile i microrganismi presenti”. 
Questa tipologia di prodotti, viste le caratteristiche fisico-chimiche e le modalità 
di conservazione, spesso rappresenta un buon substrato per la crescita di             
L. monocytogenes. 
Tra tutte le tipologie di prodotti RTE è stato dimostrato che alcuni risultano 
essere maggiormente permissivi verso il patogeno. Tra questi rientrano: alcuni 
prodotti della pesca affumicati (specialmente se a freddo), prodotti vegetali (in 
particolare IV gamma), prodotti a base di latte e prodotti a base di carne o misti 
carne/vegetali. Nella maggior parte dei casi i prodotti RTE necessitano 
fortemente del rispetto della “catena del freddo” ma le basse temperature di 
refrigerazione rappresentano un fattore di selezione dei patogeni psicrotrofi tra i 
quali, come detto in precedenza rientra L. monocytogenes (Farber et al., 1999 – 
Ryser, 1999 - Aureli,  2000).
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Secondo quanto stabilito dai recenti regolamenti comunitari l’operatore del 
settore alimentare (la principale figura incaricata della responsabilità della non 
nocività dei propri prodotti) deve compiere studi per conoscere a fondo le 
caratteristiche dei propri prodotti al fine di garantire il rispetto dei requisiti 
normativi e la salute del consumatore. 
 Tra gli studi che l’operatore può sviluppare rientrano le prove di inoculazione 
sperimentale (Challenge Test Microbiologici = MCT) e l’applicazione di modelli 
di microbiologia predittiva. 
Per prove di inoculazione si intendono analisi di laboratorio mirate alla 
valutazione del comportamento di un microrganismo (es. L. monocytogenes) 
introdotto in concentrazione nota all’interno di un prodotto alimentare e 
monitorato in tempi prestabiliti. 
Per modelli di microbiologia predittiva si intendono modelli fisico-matematici 
che simulano e valutano il comportamento di un microrganismo all’interno di un 
prodotto alimentare.  
Gli studi di modellazione predittiva vengono generalmente sviluppati al 
computer con l’applicazione di software specifici in grado di simulare il 
comportamento di molti microrganismi patogeni responsabili di malattie 
alimentari in relazione a variabili multiple (pH, Aw, temperatura, periodo di 
osservazione ecc..). 
 
In relazione a quanto sopra esposto la presente tesi, suddivisa in due parti 
(Generale e Speciale), si occupa nella parte generale di descrivere: 
 
- nel primo capitolo i cambiamenti del quadro normativo Europeo in tema 
di sicurezza alimentare a partire dalla pubblicazione del “Libro Bianco”, il 
nuovo approccio di filiera alimentare del tipo “from farm to fork” (dai 
campi alla tavola) e il concetto di rintracciabilità, l’istituzione dell’EFSA, 
il sistema RASFF (Rapid Alarm Sistem for Food and Feed), la nuova 
attribuzione delle responsabilità in tema di sicurezza alimentare e 
l’organizzazione delle attività di controllo ufficiale; 
- nel secondo capitolo le caratteristiche principali di Listeria spp. e Listeria 
monocytogenes trattandone la tassonomia, l’ecologia microbica,
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la resistenza ai disinfettanti e agli antibiotici, la presenza e lo sviluppo 
nelle diverse tipologie di prodotti RTE e la patogenesi nell’uomo e negli 
animali. 
 
- nel terzo capitolo le caratteristiche principali dei vari modelli di 
microbiologia predittiva, degli studi di challenge e la loro applicazione nei 
confronti di prodotti alimentari RTE. 
 
Nella parte speciale, capitolo 4, lo studio tratta la diretta applicazione di 
challenge test su prodotti alimentari RTE preparati in una gastronomia 
artigianale. 
Lo studio, incentrato su 10 tipologie di prodotto, ha lo scopo di analizzare il 
comportamento, durante tutto il periodo di shelf-life, di una concentrazione nota 
di L. monocytogenes inoculata in laboratorio al fine di ottenere informazioni sulla 
permissività dei prodotti esaminati nei confronti del microrganismo, per un 
corretto inquadramento dei prodotti stessi rispetto ai parametri forniti dal 
Regolamento CE 2073/2005.
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PARTE GENERALE
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Capitolo 1 
 
Normativa europea in tema di sicurezza alimentare 
 
La pubblicazione del Libro Bianco sulla sicurezza alimentare il 12/01/2000 ha 
fornito elementi per forti cambiamenti nell’organizzazione del controllo sanitario 
degli alimenti. 
Prima di trattare i cambiamenti intercorsi, è necessario fare un accenno ai punti 
caratterizzanti la vecchia regolamentazione quali: 
- un impianto legislativo che, pur essendo comune a diversi paesi 
dell’Unione Europea, era organizzato mediante direttive, molto 
dettagliate, che dovevano essere inserite nell’impianto legislativo di ogni 
paese;   
- assenza di un’istituzione unica europea di riferimento per l’analisi dei 
pericoli;  
- alcune direttive erano di difficile comprensione e, in alcuni casi,  
contraddittorie (es: requisiti strutturali a volte dettagliati  in modi diversi 
in settori produttivi differenti come nel caso di latte, carne o pesce); 
- la responsabilità della sicurezza alimentare ricadeva per lo più sulle 
autorità competenti.  
In particolare, l’esigenza europea di sviluppare una struttura normativa solida, 
comune a tutti gli Stati membri e allo stesso tempo non troppo articolata e 
“pesante” ha fatto si che siano stati emanati il Libro bianco sulla sicurezza 
alimentare, il Reg. CE 178/2002 (food-law), il “Pacchetto Igiene” (costituito 
dai regolamenti  CE 852/2004 sull’igiene dei prodotti alimentari, CE 
853/2004 sull’igiene dei prodotti alimentari di origine animale, CE 854/2004 
sui controlli ufficiali in prodotti di origine animale, CE882/2004 sui controlli 
ufficiali in alimenti e mangimi e sulla salute e benessere animale e la direttiva 
41/2004), il Reg. CE 183/2005 sull’igiene dei mangimi e il Reg. CE 
2073/2005 (e il successivo Reg. CE 1441/2007) sui criteri microbiologici 
applicabili ai prodotti alimentari.
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La nuova legislazione in tema di sicurezza alimentare può quindi essere così 
schematizzata: 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
Il 12 gennaio 2000 la Commissione delle Comunità Europee ha presentato il 
“Libro Bianco sulla sicurezza alimentare”. Tale testo esprime l’importanza di 
dare priorità assoluta alla sicurezza alimentare ed alla protezione della salute dei 
cittadini; di rivedere, aggiornare ed unificare la normativa del settore e di istituire 
un’apposita Autorità alimentare Europea indipendente con compiti di 
responsabilità di valutazione dei rischi e delle relative comunicazioni alle 
istituzioni dei Paesi Membri e a tutta la filiera agroalimentare. 
 La visione della filiera alimentare proposta dal Libro Bianco è decisamente 
innovativa e la catena alimentare è rappresentata come un percorso continuo che 
l’alimento compie “dai campi alla tavola” (“from farm to fork”), le cui tappe 
devono essere chiare, corrette e documentate in tutti i passaggi. Questo percorso 
parte dai produttori di mangimi per animali fino ad arrivare al prodotto “finito” 
destinato ai consumatori. 
Al fine di documentare in modo inequivocabile il percorso compiuto 
dall’alimento lungo la catena alimentare emerge il concetto di rintracciabilità. 
LIBRO BIANCO 
12.1.2000 
Reg . 178/ 2002 
FOOD-LAW 
PACCHETTO IGIENE 
2004 
Reg. CE 2073/2005  
Reg. CE 183/2005
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Con questo termine viene identificata la possibilità di risalire in breve tempo a 
qualsiasi anello della suddetta catena. 
La rintracciabilità, al contrario di quanto accade per il naturale iter dell’alimento, 
non ha soltanto un percorso progressivo dai campi alla tavola ma deve essere in 
grado di rendere note le varie tappe anche procedendo a ritroso e quindi dalla 
tavola ai campi. 
Le figure incaricate di documentare la rintracciabilità dell’alimento sono gli 
operatori del settore alimentare, dei mangimi e le imprese alimentari. 
Tali figure devono essere in grado di poter determinare chiaramente lungo la 
catena alimentare quanto meno l’anello a loro antecedente (anche definito a 
monte) e quello a loro successivo (a valle) secondo il principio definito “one step 
backward – one step forward” (un gradino avanti e uno indietro). 
Gli operatori devono pertanto tenere adeguati registri dei fornitori di materie 
prime e di ingredienti in modo da rintracciare, qualora si presentasse, la fonte di 
un problema. 
percorso dell’alimento lungo la catena alimentare 
  
 
 
                                   Rintracciabilità a monte / valle 
 
I ruoli e le responsabilità di tutti gli attori della catena alimentare devono perciò 
essere ben definiti. 
La responsabilità primaria, per quanto concerne la sicurezza degli alimenti spetta 
agli operatori del settore alimentare quindi a produttori di mangimi, agricoltori, 
allevatori, macellatori e così via fino al consumatore escluso; quest’ultimo, però, 
non è del tutto privo di responsabilità in quanto dopo l’acquisto è responsabile 
della conservazione, manipolazione ed eventualmente cottura dell’alimento. 
Alle autorità competenti è affidato il compito di fare rispettare a ogni figura le 
proprie responsabilità mettendo in atto sistemi di verifica, controllo e 
sorveglianza. 
Anello a 
monte 
operatore 
Anello a  
valle 
Campi Tavola
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Un'altra tematica molto importante tratta dal Libro Bianco è rappresentata dal 
maggiore interesse verso una politica alimentare uniforme a livello europeo da 
cui si sviluppa la proposta di istituzione di un’Autorità alimentare europea.  
Secondo la Commissione l’istituzione di un’Autorità europea costituisce la 
risposta più appropriata alla necessità di garantire un elevato standard di 
sicurezza alimentare e lo strumento più efficace per porre in atto i cambiamenti 
necessari per proteggere la salute pubblica e ripristinare la fiducia dei 
consumatori. 
Per far si che l’Autorità alimentare europea possa operare nel migliore dei modi e 
con la finalità di fornire un elevato livello di protezione della salute dei 
consumatori, questa dovrà avere alcune caratteristiche fondamentali: 
1) dovrà attingere alle migliori conoscenze scientifiche; 
2) dovrà essere “super-partes” e indipendente da interessi industriali e 
politici; 
3) dovrà essere aperta ad un esame rigoroso da parte del pubblico; 
4) dovrà essere scientificamente autorevole; 
5) dovrà operare in stretto contatto con gli organismi scientifici nazionali. 
Il ruolo dell’Autorità dovrà essere definito contestualmente al processo di analisi 
del rischio che si articola nella valutazione, gestione e comunicazione del rischio 
(Libro bianco sulla sicurezza alimentare- capitolo 4- 12/1/2000). 
I compiti che vengono attribuiti all’Autorità sono: 
- formulazione di pareri scientifici  mediante la raccolta mirata e l’analisi 
di informazioni ottenute sia a livello comunitario che mondiale in materia 
di sicurezza degli alimenti. Tali pareri, destinati alla Commissione, 
riguarderanno questioni in grado di avere impatto diretto o indiretto sulla 
salute e sulla sicurezza dei consumatori in relazione al consumo di 
alimenti.  
- reazione alle crisi. In caso di emergenza l’Autorità raccoglierà, analizzerà 
e distribuirà informazioni pertinenti alla Commissione e agli Stati 
Membri. In questo modo, in caso di crisi, l’Autorità assumerà un ruolo 
chiave nella pianificazione della risposta di reazione dell’Unione Europea 
che avverrà in tempi più rapidi  e con maggiore efficacia.
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- Strettamente correlato al compito di reazione alle crisi è il compito di 
creare una fitta rete di contatti scientifici attraverso tutta l’Europa ma 
anche al di fuori di essa.  
Tale rete, con al centro l’Autorità stessa, permetterà lo scambio di 
informazioni con gli organismi scientifici e le Agenzie nazionali, la 
comunicazione con i consumatori in tema di sicurezza alimentare e 
soprattutto renderà possibile sviluppare e sostenere il sistema di allarme 
rapido ovvero un nuovo sistema in grado di potere identificare e 
notificare, in tempi brevi, problemi urgenti in materia di sicurezza 
alimentare. 
L’Autorità, da quanto emerge dal Libro Bianco, deve essere una struttura che 
dovrebbe operare in stretta collaborazione con le agenzie scientifiche nazionali e 
con le istituzioni incaricate della sicurezza degli alimenti avvantaggiandosi delle 
loro esperienze. Il ruolo dell’autorità sarà pertanto di tipo proattivo, volto alla 
tutela e al mantenimento della salute dei consumatori e allo sviluppo di 
programmi di monitoraggio e sorveglianza in tema di sicurezza alimentare. 
Altri temi trattati dal Libro Bianco sono: il benessere animale, i mangimi, i 
controlli ufficiali e le importazioni. 
L’interesse per il benessere animale, non è solo strettamente legato ad un 
aspetto etico (comunque di crescente importanza e di maggiore interesse sociale) 
ma tiene conto che alcune malattie tra cui salmonellosi, tubercolosi e  listeriosi, 
possono essere trasmesse agli esseri umani attraverso alimenti contaminati.  
Per quanto riguarda i mangimi bisogna tener presente che, se la sicurezza 
alimentare parte dai campi e arriva alla tavola, è corretto affermare che la stessa 
sicurezza alimentare inizia con la sicurezza dei mangimi e di conseguenza il 
Libro Bianco afferma che: “l’industria dei mangimi dovrebbe essere sottoposta 
alle stesse prescrizioni ed agli stessi controlli rigorosi che si applicano al settore 
degli alimenti umani”. 
Oltre alle norme riguardanti i mangimi saranno introdotte norme precise circa i 
requisiti di igiene, requisiti che dovranno essere garantiti e rispettati in ogni fase 
a cui andrà incontro l’alimento. Inoltre saranno fissati limiti per quanto riguarda 
contaminanti e residui, distinguendo così le sostanze che accidentalmente e