Approcci sintetici a substrati arricchiti in 13C e D come potenziali agenti di contrasto per MRI via Dynamic Nuclear Polarization: n-13C-1,1,2,2-D4-Colina cloruro

5 
INTRODUZIONE 
 
La Risonanza Magnetica Nucleare (NMR, Nuclear Magnetic Resonance) è una tecnica di 
indagine che si basa sulla misura della precessione dello spin nucleare sotto l’effetto di un 
campo magnetico. L’applicazione di tale tecnica in medicina riguarda la visualizzazione di 
immagini NMR (Magnetic Resonance Imaging, MRI), ed è utilizzata prevalentemente per 
scopi diagnostici. Viene considerata come facente parte della radiologia, poiché genera 
immagini legate alle strutture interne del paziente. La Risonanza Magnetica fornisce 
immagini di natura differente rispetto ad altri metodi di indagine radiologica perché permette 
di visualizzare i tessuti molli, e di discriminare tra differenti tipologie di tessuti. La Risonanza 
Magnetica per Immagini sfrutta le onde radio, biologicamente più sicure dei raggi x e γ 
utilizzati nei metodi radio-isotopici; con essa possono essere ottenute immagini mediante 
l’osservazione di nuclei quali 
1
H, 
13
C, 
19
F, 
23
Na, 
31
P, ecc., ma il nucleo più utilizzato è il 
protone sia per la grande abbondanza isotopica (99.98 %) che per la grande quantità d’acqua 
contenuta in un organismo vivente. 
Nella pratica, quindi, l’uso clinico dell’MRI è ristretto all’analisi di 
1
H che, rispetto agli altri 
nuclei attivi all’NMR, è presente in concentrazioni rilevanti nell’organismo umano. In 
presenza di un campo magnetico esterno, B
0
,
 
l’intensità del segnale NMR dipende infatti dalla 
concentrazione dei nuclei attivi e dalla loro polarizzazione, definita, per nuclei con I = ½ 
(quali appunto 
1
H), come: 
 
 
dove N
+
 e N
- 
rappresentano il numero degli spin nelle due diverse orientazioni, che essi 
possono assumere rispetto a B
0
.  
 
All’equilibrio termodinamico la precedente equazione si riduce a 
 
 
dove γ è il rapporto giromagnetico dello spin nucleare in esame, h la costante di Plank, B
0
 il 
campo magnetico esterno, k
B 
la costante di Boltzmann e T la temperatura assoluta. 
All’equilibrio termodinamico e in presenza di campi magnetici in uso nelle tecniche NMR ed 
MRI, la differenza di popolazione dei livelli e di conseguenza la polarizzazione P è molto
6 
bassa e ciò comporta una bassa intensità del segnale NMR. Ad esempio, per un campo 
magnetico di 1,5 T la polarizzazione dei nuclei 
1
H è 5*10
-6 
(ovvero solo 5 protoni su un 
milione contribuiscono al segnale NMR). Mentre per il nucleo 
13
C tale polarizzazione è solo 
di 1*10
-6
. In MRI l’elevata concentrazione di acqua nei tessuti permette di superare la bassa 
sensibilità intrinseca di questa tecnica diagnostica.  
La qualità diagnostica delle immagini MRI dipende dalle diverse intensità di segnale emessi 
da tessuti adiacenti. I vari tessuti vengono differenziati nell’immagine sulla base dei tempi di 
rilassamento (T
1
 o T
2
) che li caratterizzano o della densità protonica.
1-2
 
La differenza relativa dell’intensità (I
A 
e I
B
) dei segnali di due regioni adiacenti nell’immagine 
viene chiamata contrasto ed è data da: 
 
 
 
Maggiore è la differenza fra le intensità, migliore sarà il contrasto C. Esso è determinato da 
numerosi fattori, alcuni intrinseci al campione (densità protonica, T
1
 e T
2
 dei protoni 
dell’acqua tissutale), altri di natura strumentale (sequenza usata, somministrazione di agenti di 
contrasto). In ambito medico un elevato contrasto è un requisito essenziale per ottenere 
immagini di qualità. Per migliorare la qualità dell’immagine, sia in termini di un maggiore 
rapporto segnale/rumore sia di migliore contrasto, si utilizzano agenti di contrasto 
paramagnetici costituiti da ioni Gd
3+
, Fe
3+
, Mn
2+
 che inducono una variazione locale del 
campo magnetico e, quindi, dei tempi di rilassamento senza che vi sia una modificazione della 
polarizzazione.
2
 L’uso di mezzi di contrasto in genere allunga i tempi di esecuzione di un 
esame di risonanza magnetica. Questi, invece, verrebbero notevolmente ridotti aumentando 
direttamente l’intensità del segnale del substrato. Ciò può essere ottenuto tramite un aumento 
di polarizzazione del substrato, ossia creando uno stato di non equilibrio dove la differenza di 
popolazione tra i livelli viene aumentata (fig. 1). Questo stato si dice iperpolarizzato e negli 
ultimi anni sono state studiate e messe a punto diverse tecniche per raggiungere tale scopo. 
                                                
1
 C. Ruffato, L. Buttazzoni, S. Sýkora, G. Bonera, G. Paolucci, RMN Risonanza Magnetica Nucleare in 
Medicina, Piccin, Padova , 1986.  
2
 P. A. Rinck, Magnetic Resonance in Medicine, The Basic Textbook of the European Magnetic Resonance 
Forum, ABW, Berlino, 2003.
7 
 
Figura 1: Differenza di popolazione dei livelli energetici indotti dal campo magnetico nel caso di equilibrio 
termico e nello stato iperpolarizzato. 
 
Gli agenti di contrasto iperpolarizzati agiscono quindi in maniera molto differente da quelli 
classici paramagnetici, in quanto, invece di modificare il segnale dovuto ai protoni circostanti, 
diventano essi stessi sorgente di segnale
3-4
. È possibile, quindi, sviluppare opportuni substrati 
iperpolarizzati che, una volta iniettati nel paziente e prima di decadere all’equilibrio, vengano 
metabolizzati e diano luogo a ulteriori segnali nelle immagini MRI. Se i processi metabolici, 
in cui tali mezzi di contrasto molecolari sono coinvolti, sono perturbati in presenza di 
specifiche patologie, le molecole iperpolarizzabili subiranno destini diversi nei tessuti sani e 
patologici. Questa tipologia di applicazioni ricade nel campo del cosiddetto imaging 
metabolico, ad oggi precluso alla tecnica MRI a causa della sua scarsa sensibilità intrinseca. 
Per poter esser funzionali tali agenti di contrasto devono essere caratterizzati da un elevato 
tempo di rilassamento longitudinale T
1
, perché lo stato iperpolarizzato, che deve conservarsi il 
più a lungo possibile dopo l’iniezione nel sistema circolatorio del paziente, decade 
all’equilibrio con velocità dipendente dal suo T
1
. 
Una delle possibili tecniche apparse negli ultimi anni è la polarizzazione nucleare dinamica 
(DNP) in cui un campione è posto in un campo magnetico ad alta intensità (>3T), portato a 
basse temperature (<1.5 K) e viene irradiato con microonde; quindi il campione 
iperpolarizzato è rapidamente rimosso dall’apparato di DNP, disciolto ed iniettato nel 
paziente all’interno dello strumento MRI.
5
 Nelle tecniche di iperpolarizzazione un buon 
esempio di agente di imaging è il 
13
C piruvato, attualmente in fase di sperimentazione clinica. 
Il seguente lavoro di tesi è stato incentrato sull’approccio sintetico per l’ottenimento di un 
substrato iperpolarizzato, per studiarne successivamente le possibili applicazioni nel campo 
dell’imaging metabolico. Tale substrato è la 1,1,2,2-D
4
,2-
13
C colina cloruro, analogo della 
                                                
3
 S. Mansson, E. Johansson, P. Magnusson, C. Chai, G. Hansson, J. S. Petersson, F. Sthalberg, K. Golman, 
Eur. Radiol., 16, 57, 2006. 
4
 K. Golman and J. S. Peterson, Acc. Radiol., vol 13, 8,2006; K. Golman, L.E. Olsson, O.Axelsson, 
S.Mansson, M. Karlsson and J. S. Petersson, Brit. J. Radiol., 76, S118, 2003. 
5
 Slade et al., U.S. PATENT N°7,646,200 B2, 2010
8 
colina, che l’avvento delle tecniche di iperpolarizzazione ha reso interessante per la capacità 
di seguire il metabolismo fisiologico della colina in acetilcolina nel cervello. La posizione 
13
C 
mostra il 24% di polarizzazione allo stato liquido, a seguito di iperpolarizzazione DNP, inoltre 
questo nucleo presenta un lungo T
1
 ,  che è un prerequisito per gli studi iperpolarizzati. Il 
chemical shift di questa posizione 
13
C differenzia colina ed acetilcolina l’una dall’altra e 
queste dagli altri metaboliti di colina solubili in acqua. Inoltre la sostituzione dei protoni con 
deuterio si è resa necessaria in quanto la posizione del carbonio marcato mostra maggiori T
1 
se non protonato. 
Concretamente l’organizzazione della tesi è la seguente. 
Il primo capitolo descrive la tecnica di risonanza magnetica nucleare (NMR) e le tecniche di 
iperpolarizzazione, con lo scopo di comprendere le basi chimico-fisiche della tecnica 
diagnostica MRI/DNP. 
Nel secondo capitolo sono stati introdotti i concetti fondamentali e le principali applicazioni 
dell’imaging a risonanza magnetica (MRI) con agenti di contrasto iperpolarizzati, mentre il 
terzo capitolo descrive il metabolismo cerebrale e i primi esperimenti di imaging metabolico 
applicati alla molecola di interesse colina cloruro. Il quarto capitolo comprende i risultati e la 
discussione del lavoro di tesi. Infine il quinto capitolo è costituito dalla parte sperimentale che 
comprende le procedure di sintesi.
9 
 
 
 
 
Capitolo 1 
Risonanza magnetica nucleare e 
Iperpolarizzazione
10 
1.1 Risonanza magnetica nucleare (NMR) 
La risonanza magnetica nucleare ha trovato impiego fin dai suoi albori nella chimica, come 
tecnica per la caratterizzazione sia della struttura che della dinamica delle molecole. La 
risonanza magnetica viene considerata ai nostri giorni una delle tecniche d’indagine più 
diffusa ed in grande sviluppo in svariati settori a partire dalla chimica e dalla biochimica fino 
alla scienza dei materiali.  
La risonanza magnetica nucleare è una potente tecnica non distruttiva in grado di condurre 
analisi strutturali e conformazionali di molecole complesse, analisi quantitative di miscele 
complesse, e misurazioni non invasive delle velocità di reazione di sistemi chimici in vitro e 
in vivo. 
 Lo sviluppo di spettri NMR come strumento di analisi clinica è stata stimolata dalla 
diffusione di una tecnica di analisi correlata, l’imaging a risonanza magnetica (MRI), in 
medicina clinica. L’applicazione dell’NMR in farmacologia e tossicologia è già abbastanza 
consolidata, le principali aree di sviluppo attuali sono i disordini metabolici, il trapianto di 
organi, i disturbi neurologici, ed il cancro. 
1.2 Basi di spettrometria di risonanza magnetica nucleare NMR. 
La Spettroscopia è una forma di spettrometria di assorbimento, è la misura della dipendenza 
dalla frequenza di assorbimento o emissione di energia di un sistema. L’NMR si riferisce 
all'assorbimento ed all’emissione di radiofrequenze (RF) da un nucleo posto in un campo 
magnetico; infatti in condizioni appropriate un campione immerso in un campo magnetico 
può assorbire radiazione elettromagnetica nella regione delle radiofrequenze (RF) e le 
caratteristiche del campione determinano le frequenze riemesse. L’assorbimento è funzione 
dalla presenza di determinati nuclei nella molecola. 
Tutti i nuclei possiedono una carica. In alcuni nuclei questa 
carica ruota (spin) sull’asse nucleare e questo movimento 
produce un dipolo magnetico orientato parallelamente all’asse 
(fig. 1.1). L’intensità intrinseca del dipolo generato è espressa 
in termini di momento magnetico nucleare, µ  proporzionale al 
momento angolare I : µ  I, tale proporzionalità è espressa 
dalla costante nucleare γ, detta  rapporto giromagnetico: 
 
 
Figura 1.1:la carica in rotazione 
sul protone genera un dipolo 
magnetico
11 
Il momento angolare della carica in rotazione può essere descritto in termini di numeri 
quantici di spin I: tali numeri possono essere calcolati in base alla massa atomica ed al 
numero atomico (tabella1). 
Tabella 1 
I Massa atomica Numero atomico Esempi 
Semi-intero 
Intero 
Zero 
Dispari 
Pari 
Pari 
Dispari o pari 
Dispari  
Pari 
1
H, 
15
N, 
13
C, 
17
O 
2
H, 
14
N 
12
C, 
16
O 
 
Per ottenere spettri NMR dai nuclei è necessario uno spin nucleare I≠0 (nuclei con I=0 sono 
magneticamente inattivi, per es. 
12
C). Tra i nuclei, con spin nucleare non nullo, quelli più 
largamente utilizzati sono quelli che possiedono numero di spin I=1/2, come i più impiegati 
1
H e 
13
C.  
Il numero di spin determina il numero delle orientazioni che il nucleo può assumere in un 
campo magnetico esterno uniforme, in accordo con la formula 2I+1. Ad esempio nel caso del 
protone, con I= ½ ,(fig. 1.2 e 1.3) la presenza di un campo magnetico esterno genera due 
livelli energetici con un leggero eccesso della popolazione protonica dello stato ad energia 
inferiore (N
α 
< N
β 
), in accordo con la distribuzione di Boltzamm. I livelli sono indicati con α 
e β oppure +1/2 e -1/2. 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
Figura 1.2: i due livelli energetici del protone in un campo magnetico di intensità B
o 
 . N è la popolazione. 
La direzione del campo magnetico (   ) è parallela all’asse delle ordinate.
12 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
La differenza energetica, ΔE fra i due livelli α e β, è data dalla formula:  
 
 
dove h è la costante di Plank e γ è il rapporto giromagnetico; poiché h, γ, π sono costanti si 
stabilisce che ΔE è proporzionale a B
0
 che rappresenta l’intensità del campo magnetico 
(espressa il Tesla, T). 
Per osservare la risonanza, i nuclei posti all’interno di un campo magnetico devono essere 
irradiati con radiazione elettromagnetica, la cui frequenza (ν) deve corrispondere alla 
frequenza di precessione dei nuclei, ovvero la cui energia deve essere uguale a quella che 
separa i due livelli α e β. L'energia RF promuove la transizione fra questi livelli energetici in 
un campo magnetico stazionario di intensità B
0  
in quanto viene assorbita dai nuclei in stato di 
energia di spin più bassa, elevandoli allo stato di più alta energia di spin. Questo porta a un 
assorbimento netto di energia RF. L’equazione che correla la radiofrequenza ν applicata 
(misurata in megahertz MHz) con l’intensità del campo magnetico è: 
          dato che              
Figura 1.3: (a) In assenza di campo magnetico esterno, gli spin sono orientati a caso; (b) Applicato un 
campo magnetico ogni spin può assumere due orientazioni, parallela o antiparallela, a diversa energia.
13 
 
 Poiché la differenza di energia tra i due stati è proporzionale alla forza del campo magnetico, 
più forte è il campo, maggiore è la differenza tra le due popolazioni, e più forte è il segnale. 
Per ogni nucleo atomico particolare, in un campo magnetico costante nel vuoto, c'è una 
singola frequenza di risonanza. 
I nuclei sono circondati da nuvole elettroniche che 
esercitano un piccolo, ma significativo effetto schermante. 
Il grado con cui un nucleo magnetico è schermato dal 
campo applicato dalla nuvola elettronica determina la 
frequenza di precessione, ovvero più densa è la nube di 
elettroni (maggiore difesa), più bassa è la frequenza di   
precessione. 
Se il nucleo viene immerso in un campo magnetico 
stazionario B
0 
(fig. 1.4), si avrà una rotazione (precessione) 
di µ intorno alla direzione di B
0
 (asse z, fig. 1.5) con una 
ben precisa frequenza angolare ω
0
, detta frequenza di 
Larmor (uguale alla frequenza di precessione del nucleo), che è legata al campo magnetico 
dalla relazione: 
 
 
dove γ è una costante che dipende dal tipo di nucleo caratteristico dell’elemento chimico sotto 
esame. 
La frequenza di precessione di un particolare nucleo è proporzionale alla forza del campo 
magnetico. 
Nell’NMR la risultante dei singoli momenti magnetici µ dei 
singoli nuclei viene detto vettore di magnetizzazione M. 
Allo stato di equilibrio la direzione del vettore di 
magnetizzazione M è parallela al campo magnetico statico 
B
0
 nel quale la sostanza è immersa. Se deviato dalla sua 
direzione (inclinato sul piano xy), il vettore di 
magnetizzazione M ritorna all’equilibrio (sull’asse z tramite 
rilassamento). 
L’evoluzione di M nel tempo durante il ritorno all’equilibrio è caratteristico del composto 
indagato e costituisce l’oggetto di tutte le misure di risonanza magnetica. Il segnale viene 
rivelato come una tensione indotta su di un induttore dalle variazioni del vettore M. 
Figura 1.4 
Figura 1.5