Stress ossidativo nei giorni di vita commerciale di Sparus aurata

Introduzione 
 
 1 
CAPITOLO  1 
 
Introduzione 
 
 
1.1.  Specie reattive dell’ossigeno (ROS) e stress ossidativo 
 
L’ossigeno (O
2
) è una molecola fondamentale nei principali processi 
biochimici degli organismi aerobi, ma allo stesso tempo il suo consumo 
porta alla formazione di specie reattive dell’ossigeno (ROS) potenzialmente 
tossiche, responsabili di danni ad 
ogni tipo di macromolecola 
biologica, quali cellula, tessuto o 
organo. Nelle cellule sane i 
mitocondri (Fig.1) consumano più 
del 90% dell’ossigeno cellulare e 
Fig.1. Il mitocondrio sede dei ROS.     sono considerati la maggior sede di 
produzione cellulare aerobica dei ROS (Boveris e Chance, 1973; Staniek e 
Nohl, 1999; Lenaz, 1998; Han et al., 2001). Nel mitocondrio, infatti, circa l’ 1-
4% dell’ossigeno non viene convertito correttamente in due molecole 
d’acqua a causa della dispersione di elettroni che risulta da imperfezioni 
nella catena respiratoria (Fig.2).  
                                        1
O
2
 
      
                                     
 
Fig.2.  Reazioni di riduzione univalenti di ossigeno ad acqua con formazione      
di ROS.
     
           
  hv 
O2
•
 H2O2 
+e +e +e +e 
H+  H+ H+ H+ 
H+ 
+e 
•OH H2O 
 
Reazione completa: O2  + 4e
-
  4H
+                              
2H2O 
OO O2
Introduzione 
 
 2 
Inoltre, i ROS sono generati anche da sistemi microsomali del reticolo                                                       
endoplasmatico (Chu e LA Peyre, 1993; Winston et al., 1996) e da varie 
reazioni enzimatiche ossidasi mediante la riduzione univalente dell’ossigeno 
molecolare ad anione superossido (O
2
•
), a causa della fuga di elettroni dalla 
NADPH citocromo P450 reduttasi, dalla ipoxantina/xantina ossidasi, dalla 
NADPH ossidasi, dalla lipo-ossigenasi e dalla ciclo-ossigenasi. 
 
                            
L’anione superossido può portare alla produzione di altri proossidanti, come 
perossido di idrogeno (H2O2), radicale idrossile (OH
•
), ossigeno singoletto 
(
1
O 2) (Fig.3) (Babior M., 1984).  
 
 
Fig.3. Attività delle specie reattive dell’ossigeno (ROS). 
 
Il radicale idrossile e l’anione superossido sono definiti radicali liberi 
dell’ossigeno in quanto sono specie chimiche capaci di un’esistenza 
indipendente (da questo il termine libero) che contengono uno o più elettroni 
spaiati sull’orbitale più esterno. Tale disposizione rende queste specie 
chimiche molto instabili e molto più reattive dell’atomo o della molecola da 
cui derivano. Pertanto, i radicali liberi tendono a legarsi e a reagire con altre 
molecole, creando nuovi radicali instabili e dando inizio a reazioni a catena 
che finiscono per modificare e quindi danneggiare le strutture biologiche 
cellulari (lipidi di membrana, proteine, acidi nucleici, carboidrati).
Introduzione 
 
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Il perossido di idrogeno e l’ossigeno singoletto,  invece, sono definiti ROS 
non radicalici (non hanno cioè elettroni spaiati sull’orbitale più esterno) 
capaci di ossidare biomolecole, quindi hanno un comportamento biologico 
similare ed altrettanto dannoso.  
Quando i radicali liberi reagiscono con i non radicali, il risultato è un nuovo 
radicale libero capace di estendere e propagare il danno, in una reazione a 
catena in grado di automantenersi ed amplificarsi. 
Il termine ROS include anche ozono (O
3
), idrogeno (H), ossigeno (O
+
), 
perossidi lipidici (LOOH), radicale alcossile (LO•), radicale perossile (LOO•), 
ossido nitrico (NO), diossido di azoto (NO
2
), nitrito perossile (ONOO), 
acido ipocloroso (HOCl), radicale tiilico (GS•) (Fridovich, 1978). 
I radicali liberi possono essere elencati mediante i potenziali di reazione di 
un unico elettrone in milliVolts (mV) a pH 7.0 (Tab.1).  
 
Radicali mV 
.
OH (idrossile) +2300 
.
LO (alcossile) +1600 
LOO
.
 (perossile) +1000 
.
GS (glutatione) +920 
.
HU
-
 (urato) +590 
.
Toc (tocoferolo) +480 
.
Asc
-
 (ascorbato) +282 
Fe
3+
-EDTA  +120 
                                      Tab.1. Potenziale di reazione dei radicali 
 
La forma ridotta di ogni radicale è capace di neutralizzare (ridurre) i radicali 
liberi che hanno un potenziale più alto. Come si può osservare dalla tabella 
il radicale idrossile (•OH) ha il potenziale più alto ed è il più distruttivo 
(reattivo) dei radicali liberi biologici.
Introduzione 
 
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Contro l’instabilità dei ROS ed i loro effetti dannosi  sulle cellule e sui tessuti, 
i pesci, come altri vertebrati, possiedono un sistema di difesa antiossidante il 
quale utilizza meccanismi enzimatici e non-enzimatici.  
Quando l’attività di questi sistemi di difesa antiossidanti non riesce a 
neutralizzare o a limitare il danno dei ROS determina uno stato di stress 
detto “stress ossidativo” (Selye, 1950). Lo stress ossidativo implica 
l’aumento della produzione intra- ed extracellulare di ROS e di conseguenza 
ossidazione lipidica, frammentazione e ossidazione delle proteine e danno 
al DNA.  
 
1.2.  Ossidazione lipidica  
 
L’ossidazione lipidica è definita come deterioramento ossidativo dei lipidi 
polinsaturi dovuto all’azione dei radicali liberi (Vossen et al., 1993).  
Nei pesci i lipidi sono caratterizzati da alti livelli di acidi grassi polinsaturi a 
catena lunga (ω-3 PUFA) che sono molto suscettibili al deterioramento sia 
da ossidazione che da idrolisi . I doppi legami in PUFA contengono idrogeni 
con legame di energia che in presenza delle specie reattive dell’ossigeno o 
di altri radicali liberi, li rendono altamente suscettibili alle reazioni di 
estrazione dell'idrogeno che iniziano e propagano una reazione a catena 
conosciuta generalmente come autossidazione (Gardner, 1989; Porter et 
al.,1995). L’autossidazione rappresenta il principale meccanismo di 
ossidazione lipidica negli alimenti che porta alla produzione di idroperossidi 
(LOOH) (Frankel, 1985). La temperatura, l’area della superficie del lipide 
esposto all’aria e i metalli di transizione, quale rame e ferro, sono inoltre i 
fattori che possono influenzare la velocità di ossidazione. L’autossidazione 
dei lipidi procede mediante un meccanismo a catena  che implica tre 
successivi step: 1) la fase di iniziazione cioè di innesco e di formazione dei 
primi radicali liberi e dei corrispondenti idroperossidi; 2) la fase di
Introduzione 
 
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propagazione delle reazioni a catena dei radicali liberi con formazione degli 
idroperossidi; 3) la fase di terminazione ovvero di incontro tra i radicali liberi 
con formazione di prodotti non-radicali (Fig. 4). 
 
 
    Fig.4.  Illustrazione schematica del processo dell’ossidazione lipidica. 
    LH = lipide insaturo, X· = iniziatore, L· = radicale alchilico , LO· = radicale  
    alcossile, LOO· = radicale perossile, LOOH = idroperosside, AH =   
    antiossidante. 
                       
L’ossidazione lipidica è influenzata da diversi sistemi catalitici per 
l’attivazione dell’ossigeno. Per superare la restrizione del movimento 
rotatorio tra lo stato di base dell’ossigeno e dei lipidi, la reazione richiede 
l’iniziazione (o l’iniziatore: X•) che può essere l’attivazione dello stato di base 
dell’ossigeno (³O
2
) nell’ossigeno singoletto (¹O
2
), superossido (O
2
•¯), 
radicale ossidrile (HOO•), o perossidi (LOOH), o trasformazione di lipidi 
insaturi nei radicali lipidici (L•).  
 
Iniziazione:                  LH + O
2 
---> L· + ·OH 
 
Propagazione:             L· + O
2
 ---> · + LOO· 
                                    LOO· + LH ---> L· + LOOH  
                                    LOOH ---> LO· + HO· 
   
Terminazione:             L· + L· ---> L--L  
                                    L· + LOO· ---> LOOL 
                                    LOO· + LOO· ---> LOOL + O
2
Introduzione 
 
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Nella maggior parte dei casi, l’autossidazione inizia in presenza di iniziatori 
con l’estrazione di un atomo di idrogeno da un gruppo metilene allelico di un 
acido grasso insaturo per produrre il radicale libero.  
Successivamente, la reazione procede attraverso le reazioni di 
propagazione, durante le quali i radicali liberi vengono convertiti in altri 
radicali per via di una reazione a catena che consuma ossigeno e produce 
nuove specie di radicali liberi (radicali perossili). Le reazioni a catena di 
propagazione sono un processo continuo finchè i lipidi insaturi o le molecole 
di acido grasso sono disponibili (Gordon, 1990; Jadhav et al., 1996). Infine, 
nella reazione di terminazione due radicali liberi si combinano per produrre i 
non-radicali. Nella fase di propagazione quando i radicali lipidici reagiscono 
con l’ossigeno, si formano gli idroperossidi lipidici (Fig.5).  
 
Fig.5. Attacco di un acido grasso da radicale libero. 
 
Un radicale dell’ossigeno può iniziare una reazione a catena che si conclude 
con la conversione di centinaia di catene laterali degli acidi grassi in 
idroperossidi lipidici (Halliwell, 1991). Essi sono relativamente stabili a causa 
della presenza di alcuni metalli allo stato ionico e si demoliscono già nel 
periodo di induzione della reazione, dando origine a radicali alcossilici (LO•).
Introduzione 
 
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 La transizione degli ioni metallo (Me), come ferro e rame, come pure 
componenti ematici catalizzano la loro decomposizione sia durante 
l’ossidazione che durante la riduzione:    
  LOOH + Me
 n+  
→ LO• + OH + Me
 n+1 
 
  LOOH + Me
 n+1 
→ LOO• + H
+ 
+ Me
 n+  
         
                       
L’accumulazione di idroperossidi lipidici in una membrana cellulare altera la 
sua fluidità, fa crollare la sua funzione, ed eventualmente la fa collassare 
(Halliwell, 1991; Martinez-Cayuela, 1995).  
Le transizioni degli ioni metallo, quindi, sono importanti proossidanti per 
l’inizio dell’ossidazione lipidica. Nei tessuti biologici come il muscolo dei 
pesci, altri componenti come proteine, aminoacidi e ascorbato possono 
interagire con questi radicali liberi per terminare la reazione. I componenti 
diversi dai lipidi che terminano la reazione sono spesso definiti come 
“antiossidanti”. L’energia di attivazione dell’ossidazione lipidica è molto più 
alta in presenza di antiossidanti perché essi abbassano il livello di 
ossidazione aumentando l’energia di attivazione (Frankel, 1998a).