Il mutante 55-99 della classe Twine-Like di Drosophila melanogaster è caratterizzato da sterilità maschio-specifica, con difetti meiotici nella citochinesi e nella formazione di spermatozoi maturi

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1. INTRODUZIONE 
 
Il mio lavoro di tesi è consistito nell‟analisi di un mutante meiotico 
appartenente ad una collezione unica di 13 mutazioni recessive maschio 
sterili, indotte da etilmetansulfonato (EMS). Questo agente mutante è 
stato utilizzato per produrre mutazioni puntiformi localizzate sui 
cromosomi 2 e 3 di Drosophila melanogaster. Tale collezione è stata 
prodotta nel Dipartimento di Biologia, dell‟Università di Washinton, 
Seattle. 
L‟analisi di questi ceppi permette di ottenere preziose informazioni sulla 
spermatogenesi maschile, sui suoi meccanismi di regolazione, sui fattori 
coinvolti e sulla loro interazione. 
Di particolare importanza è l‟utilizzo della Drosophila melanogaster come 
organismo modello per i notevoli vantaggi che essa offre. Il primo 
fattore è l‟estrema facilità di analisi genetica, in quanto le drosophile 
hanno un ricambio generazionale di circa 14 giorni a 25°C e la femmina 
può deporre fino a 600 uova in 10 giorni (Fig.1); tutto ciò permette di 
ottenere velocemente una progenie specifica dagli incroci programmati.
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Fig. 1 : Ciclo vitale di D. melanogaster. 
Un altro fattore importante è la facilità di indagine che riserva questo 
organismo. In pochi minuti si possono ottenere i tessuti da analizzare (i 
testicoli) con una semplice dissezione. La natura stessa 
dell‟organizzazione testicolare facilita il riconoscimento dei vari stadi di 
sviluppo e il confronto fra il normale fenotipo wildtype e un qualsiasi 
fenotipo mutante. Le cellule spermatiche, infatti, sono localizzate in 
sequenza temporale, con le cellule staminali all‟apice del testicolo e le 
cellule progressivamente più differenziate verso l‟estremità basale (Fig.2).
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Fig. 2 : Organizzazione temporale del testicolo di D. melanogaster. 
Non dimentichiamo inoltre che su questo piccolo moscerino si basa gran 
parte della genetica classica. Infatti, gli studi di Morgan sui principi base 
dell‟eredità in D. melanogaster, verso gli anni „10 del secolo scorso, hanno 
contribuito a fare luce su fenomeni genetici fondamentali, come l‟eredità 
legata al sesso, la localizzazione dei geni sui cromosomi, l‟epistasi, gli 
alleli multipli e la mappatura genetica; ma anche l‟analisi dell‟effetto di 
posizione, l‟eterocromatizzazione e lo studio dei geni che controllano lo 
sviluppo. Nel 1998 è stato sequenziato l‟intero genoma della Drosophila. 
Esso è constituito da 165 milioni di coppie di basi per un totale di 14000 
geni. Pur conoscendo interamente il DNA dal punto di vista molecolare, 
sono ancora molti i processi da definire completamente. Ancora oggi
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molteplici ricerche sono condotte su questo organismo modello, grazie 
anche alla grande varietà di ceppi mutanti isolati, associati a 
modificazioni fenotipiche che ne facilitano il riconoscimento (Fig. 3). 
 
Fig. 3 : Mutazioni fenotipiche in D. melanogaster. 
Ultimo fattore, ma sicuramente non meno importante, riguarda la 
similitudine da un punto di vista genetico tra gli altri organismi, 
compreso l'uomo, e il moscerino della frutta. Circa il 75% delle malattie 
genetiche conosciute sono riconducibli a geni che si individuano nel 
corredo genetico della D. melanogaster. Circa il 50% delle proteine del 
moscerino hanno un analogo nei mammiferi. Ad oggi la Drosophila viene 
utilizzata come modello genetico per lo studio di varie malattie umane, 
inclusi i disturbi neurodegenerativi come il morbo di Parkinson, la corea 
di Huntington e il morbo di Alzheimer; ma anche per altri fenomeni 
clinici come il diabete, il cancro e l‟invecchiamento.
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1.1. Spermatogenesi in Drosophila 
La spermatogenesi in Drosophila è un processo molto complesso che, 
come nella maggior parte delle specie a riproduzione sessuale, prevede il 
susseguirsi di divisioni mitotiche e meiotiche, seguite da profonde 
trasformazioni morfologiche. A partire da una cellula staminale 
germinale si giunge, attraverso un programma di sviluppo finemente 
regolato, alla formazione di spermatozoi maturi mobili, che per nulla 
assomigliano alle cellule iniziali. 
 
Fig. 4 : Testicoli di D. melanogaster. 
Il testicolo di Drosophila è un lungo tubo, con un‟estremità apicale dritta e 
un‟estremità basale arrolotolata (Fig. 4). I diversi stadi di sviluppo delle 
cellule spermatiche sono organizzati, all‟interno del testicolo, in ordine
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sequenziale. L‟apice costituisce il centro germinativo, caratterizzato dalla 
presenza di cellule piccole e molto vicine, con il nucleo interamente 
occupato dalla cromatina, chiamate spermatogoni. Procedendo verso 
l'estremità basale troviamo le cellule nelle varie fasi di differenziamento, 
via via più avanzate. Dopo una prima fase caratterizzata da 4 divisioni 
mitotiche successive, che a partire da un singolo spermatogonio origina 
una cisti di 16 spermatociti maturi, segue la meiosi che genera una cisti di 
64 spermatidi aploidi. Questi, terminato il loro differenziamento, si 
trasformeranno in spermatozoi maturi individualizzati (Fig. 5). 
 
Fig. 5 : Schema completo della spermatogenisi di D. melanogaster. (Fuller et al., 1998)
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1.1.1. Fase mitotica 
Ogni cellula staminale germinale subisce una divisione asimmetrica da 
cui scaturiscono una nuova cellula staminale e una cellula goniale. La 
cellula staminale serve per mantenere la popolazione germinale, mentre 
quella goniale intraprende la via del differenziamento. 
La cellula goniale subisce una serie di quattro divisioni mitotiche che 
determinano la formazione di una cisti di 16 spermatociti primari, 
affiancati da due cellule somatiche della cisti. Essendo la citochinesi 
incompleta, queste cellule rimangono interconnesse da ponti 
citoplasmatici stabili che ne permettono lo sviluppo sincrono. 
1.1.2. Fase pre-meiotica 
Gli spermatociti primari in sviluppo subiscono una serie di 
trasformazioni morfologiche molto profonde. Il loro volume nucleare 
aumenta di 25 volte in seguito alla produzione dei trascritti primari di un 
gran numero di geni. Alcuni di essi sono tradotti immediatamente, 
mentre altri vengono mantenuti stabili per molti giorni dopo la meiosi e 
sono utilizzati nelle fasi più tardive dello sviluppo (Olivieri et al., ‟65). 
Successivamente, nello stadio di spermatocita polare, il nucleo diventa 
eccentrico. I mitocondri si distribuiscono in maniera asimmetrica,
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concentrandosi al polo opposto del nucleo. In questo stadio la cromatina 
si trova divisa in tre masse compatte, formate dagli omologhi appaiati, 
vicine all'involucro nucleare interno. Questi complessi (clumps) si 
distanzieranno l‟uno dall‟altro con il procedere dello sviluppo, 
occupando territori ben distinti. Le due masse più grandi e dense 
corrispondono ognuna alle coppie di autosomi metacentrici; la terza 
massa è composta dai cromosomi sessuali, X e Y, mentre la coppia dei 
cromosomi 4, molto piccoli, formano un piccolo spot molto 
fluorescente, che non è sempre visibile. Successivamente il nucleo 
riprende la posizione centrale e subisce un ulteriore aumento della taglia 
e i mitocondri si disperdono nel citoplasma in maniera uniforme. Il 
nucleolo scompare e la cromatina continua a condensarsi. 
1.1.3. Fase meiotica 
La profase della meiosi I nella linea germinale maschile non presenta le 
carettistiche citologiche che convenzionalmente definiscono lo stadio di 
profase, ovvero la presenza del complesso sinaptonemale e la 
ricombinazione meiotica (Fuller et al., ‟98). 
In prometafase I i nuclei si contraggono e diminuiscono il loro diametro 
del 20% rispetto allo spermatocita maturo. I centrosomi si duplicano e
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appaiono costituiti ognuno da un paio di centrioli, i quali migrano dalla 
membrana plasmatica alla membrana nucleare. In questo sito, i centrioli 
enucleano i microtubuli astrali. Gli aster, inizialmente dislocati sullo 
stesso lato del nucleo, migrano ai poli opposti, rimanendo comunque 
vicini all'involucro nucleare esterno. La cromatina raggiunge un elevato 
grado di condensazione. I bivalenti, cioè i cromosomi omologhi appaiati 
che all'inizio si trovano dislocati sull'involucro nucleare interno, in 
seguito alla sua rottura, si muovono liberamente nel nucleoplasma. 
Dapprima i nuclei sono tondi o leggermente ovali, ma in seguito 
diventano di forma irregolare. Gli aster diventano sempre più 
pronunciati e le poche fibre del fuso che irradiano da essi raggiungono i 
bivalenti contattandoli attraverso il cinetocore. I cromosomi inizialmente 
occupano varie posizioni all'interno del nucleo ma, in seguito, fibre 
addizionali si connettono ai bivalenti cominciando a orientarli sulla 
piastra metafasica. 
La prometafase termina quando i bivalenti raggiungono l‟allineamento in 
piastra, guidati delle fibre del fuso meiotico. 
Durante la metafase I i bivalenti si aggregano in singole strutture 
equidistanti dai poli e ad essi connesse da due set simmetrici di 
microtubuli. Inoltre, il fuso in metafase mostra dei fasci di microtubuli
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che non incontrano i cromosomi, i quali sembrano originarsi da un polo 
per raggiungere il polo opposto. 
I movimenti iniziali dei cromosomi in anafase I sono molto rapidi. 
L'organizzazione del fuso delle cellule in anafase è molto simile a quella 
delle cellule in metafase, in quanto consiste in due mezzi fusi a forma di 
ombrello, posti vicini l'uno all'altro. Tuttavia con il procedere dell‟anafase 
i microtubuli si riorganizzano: la densità dei microtubuli fra i due set di 
cromosomi omologhi segreganti progressivamente aumenta mentre il 
numero di microtubuli posti in prossimità dei cromosomi diminuisce. I 
microtubuli emanati da ciascun polo si sovrappongono nella regione 
centrale del fuso, così che i due mezzi fusi opposti a forma di ombrello si 
fondono nuovamente in un'unica struttura ovale. 
La telofase I è caratterizzata da un'ulteriore riduzione nel numero dei 
microtubuli emanati dai centrosomi e da un apparente incremento della 
densità dei microtubuli del fuso centrale. Avviene un ulteriore aumento 
nella distanza fra i due nuclei figli. Il denso fascio di microtubuli del fuso 
centrale viene progressivamente strozzato al centro in modo da 
raggiungere una forma a clessidra, spesso curvata da un lato. Con il 
procedere della meiosi, i nuclei in telofase aumentano di volume e 
diventano visibili gli aster della seconda divisione che promanano dai