32
CAPITOLO SECONDO
“NMR E RILASSOMETRIA: PRINCIPI, METODI E TECNICHE SPERIMENTALI”
Introduzione
La risonanza magnetica nucleare ( NMR ) è un metodo spettroscopico usato per osservare
la riorientazione degli spin nucleari in un campo magnetico applicato.
La spettroscopia NMR ad Alta Risoluzione si è guadagnata un ruolo importante tra i
metodi per la caratterizzazione degli alimenti, in virtù della sua abilità pressoché unica
nell’identificazione ( e quantificazione ) di tutti i più diffusi composti a basso e medio peso
molecolare; l’utilizzo invece della tecnica NMR a Bassa Risoluzione, pur mancando
dell’informazione sul chemical shift, permette l’acquisizione di un segnale di singolo
assorbimento da parte di tutti gli
1
H presenti nel campione. Questo approccio si è
dimostrato particolarmente vantaggioso nell’investigazione di sistemi a fasi differenti
( solido/ liquido, acqua/ grassi… ), dove comunque i tempi di rilassamento del solvente,
ottenuti su un range esteso di campi magnetici, recano anche informazioni sulle molecole
di soluto disciolte, fondamentali per la caratterizzazione del campione in esame.
I nuclei che, per le loro proprietà magnetiche, vengono più comunemente usati nella
spettroscopia NMR sono
1
H,
13
C,
19
F,
23
Na e
31
P.
33
Il fenomeno della Risonanza Magnetica Nucleare
Il nucleo dell’atomo ruota attorno al proprio asse ( movimento di spin ) e quindi possiede
un momento angolare; essendo carico, possiede anche un momento magnetico
N
.
Ponendo l’atomo all’interno di un campo magnetico ( B
0
), l’energia d’interazione fra il
campo esterno e il momento magnetico del nucleo dipenderà dalla loro orientazione
relativa ( Figura 2.1 ).
Da un punto di vista classico, l’azione di B
0
su
N
è quella di una coppia di forze che tende
ad orientarlo parallelamente al campo magnetico. Poichè
N
ruota su se stesso, la direzione
della coppia varia continuamente ed il risultato è che
N
ruota intorno a B
0
descrivendo un
cono di precessione con una frequenza angolare, detta frequenza di Larmor (
L
).
Figura 2.1:
N
ruota intorno a B
0
descrivendo un cono di precessione alla frequenza di Larmor.
Tale frequenza è caratteristica per ogni nucleo e proporzionale a B
0
:
L
= B
0
[rad∙s
-1
]
( = rapporto giromagnetico del nucleo )
Per effetto della quantizzazione i livelli energetici degli atomi sono discreti e, quindi, il
numero di orientazioni che un nucleo può assumere è limitato e dipende dal numero
quantico di spin nucleare I. La differenza di energia, relativa alle diverse orientazioni,
dipende dall’intensità del campo magnetico applicato ed è dello stesso ordine di grandezza
dell’energia delle onde radio.
In realtà, ogni nucleo risente di un campo magnetico effettivo diverso dal campo applicato
e risuona ad una frequenza caratteristica. Tale campo magnetico effettivo viene descritto
Orbita di precessione
ppprecessprecession
e
B
0
Dipolo
magnetico
34
come B = B
0
(1- ), dove è la costante di schermo, dipendente dalla densità e dalla
distribuzione elettronica attorno al nucleo; la densità elettronica dipende a sua volta dalla
struttura del composto.
Il fenomeno del rilassamento
Consideriamo il semplice atomo di
1
H per descrivere il fenomeno del rilassamento.
All’interno del campo B
0
lo spin nucleare dell’atomo di idrogeno ( I = 1/ 2 ) può assumere
due orientazioni rispetto al campo stesso: spin parallelo, favorito energeticamente, e spin
antiparallelo. La separazione energetica tra i due livelli è pari a h B
0
.
La maggior parte degli spin protonici si dispone parallelamente al campo magnetico
esterno generando una magnetizzazione netta ( M
0
) lungo la direzione di B
0
( Figura 2.2 ).
Figura 2.2: La maggior parte degli spin protonici si dispone parallelamente al campo magnetico
esterno generando una magnetizzazione netta ( M
0
) lungo la direzione di B
0
.
La differenza di popolazione tra i due livelli dipende dalla loro differenza di energia e dalla
temperatura secondo la legge di Boltzmann:
N
l
= numero di spin ad energia minore
N
u
= numero di spin ad energia maggiore
k = costante di Boltzmann
T = temperatura
Inviando un impulso di onde radio, con frequenza uguale a quella di Larmor dei protoni,
gli spin entrano in risonanza con la radiazione e quelli energeticamente più poveri
assorbono energia, disponendosi in posizione antiparallela. Il numero di spin che invertono
la loro orientazione dipende dalla durata dell’impulso. Se questa è tale per cui il numero di
spin paralleli diventa uguale al numero di spin antiparalleli, la magnetizzazione lungo
l’asse del campo ( asse z ) diventa nulla ed il vettore di magnetizzazione giace sul piano
B0 M0
kT
E
exp
N
N
u
l
35
perpendicolare ( piano xy o piano del rilevatore ): si è ottenuta una rotazione del vettore di
90°. Se l’impulso provoca un’inversione del rapporto delle popolazioni si ottiene una
rotazione di 180°. Al termine dell’impulso i protoni ritornano al loro stato iniziale
( rilassamento ) emettendo energia e generando il segnale misurato dagli strumenti NMR.
L’analisi del segnale e della sua evoluzione nel tempo fornisce informazioni sulla
concentrazione protonica e sull’intorno molecolare. Il rilassamento, infatti, può avvenire
solo attraverso la cessione dell’energia assorbita dallo spin nucleare al suo intorno
molecolare, che viene definito reticolo; affinché questo trasferimento di energia si possa
realizzare è necessario che lo spin nucleare si possa accoppiare con campi magnetici
fluttuanti, generati nell’intorno molecolare dello spin. Il rilassamento dello spin nucleare è
efficace soltanto quando la frequenza di fluttuazione dei campi magnetici del reticolo è
pari alla sua frequenza di Larmor.
Tempi di rilassamento
Si possono definire due tempi di rilassamento per le due componenti, longitudinale e
trasversale, del vettore di magnetizzazione.
Il primo è il tempo di rilassamento spin- reticolo o longitudinale ( T
1
) che è il tempo
necessario affinché, dopo un impulso a 90°, la componente longitudinale ( M
z
) della
magnetizzazione, allineata lungo la direzione del campo magnetico esterno, ritorni allo
stato di equilibrio ( M
0
):
1
0 Z
T
t
exp 1 M t M
Figura 2.3: Variazione della magnetizzazione longitudinale in funzione del tempo.
Mz
M0
t
36
Misurando T
1
in vivo si è osservato che la velocità di rilassamento dei protoni dell’acqua
libera è diversa da quella dell’acqua immobilizzata in sistemi macromolecolari, ad esempio
proteine o membrane. Le molecole libere infatti si muovono con velocità più elevate
rispetto alla frequenza di Larmor dello spin nucleare ed il fenomeno del rilassamento
risulta poco efficace. Il rallentamento del moto, conseguente all’interazione dell’acqua con
un sistema macromolecolare, fa sì che la fluttuazione dei campi che inducono il
rilassamento sia più vicina a quella di precessione dei protoni dell’acqua, che perciò
rilassano più velocemente.
Il secondo è il tempo di rilassamento spin- spin o trasversale ( T
2
)
che è il tempo
necessario affinché la componente trasversale della magnetizzazione, cioè quella che si
trova nel piano xy perpendicolare alla direzione del campo magnetico esterno, torni al
valore di equilibrio:
2
0 y
T
t
exp M t M
Figura 2.4: Variazione della magnetizzazione trasversale in funzione del tempo.
Durante questo processo non vi è trasferimento di energia dallo spin al reticolo, ma uno
sfasamento degli spin nucleari, generato da uno scambio simultaneo di due spin tra i due
livelli energetici; il T
2
quindi rappresenta il tempo necessario affinché due nuclei adiacenti
si scambino l’orientazione. L’energia complessiva del sistema rimane in questo modo
costante.
E’ importante sottolineare che i due processi di rilassamento avvengono simultaneamente e
che tutti i meccanismi che sono efficaci nel determinare il tempo di rilassamento
longitudinale concorrono anche a quello trasversale. Esistono però alcuni meccanismi, ed
in particolare tutti quelli relativi ai moti dotati di una componente statica allineata lungo
My
M0
t
37
l’asse del campo magnetico esterno, che influenzano solo il T
2
che così può assumere
valori minori o uguali a T
1
.
Figura 2.5: Processo di rilassamento. Il rivelatore, che è posto sul piano xy, registra un segnale
dipendente dal tempo detto FID ( Free Induction Decay ), che verrà poi convertito in un segnale
dipendente dalla frequenza attraverso una trasformata di Fourier ( FT ).
L’evoluzione temporale della componente della magnetizzazione sull’asse y è descritta
nella Figura 2.5.
Processi di rilassamento nella spettroscopia NMR in soluzione
Tutte le interazioni cui è soggetto un sistema di spin in soluzione fluttuano nel tempo a
causa del moto rotazionale e traslazionale delle particelle: in condizioni isotropiche tuttavia
la maggior parte di queste interazioni viene mediata a zero e solo alcune di esse,
l’interazione con il campo magnetico esterno e l’accoppiamento indiretto con altri spin,
influenzano l’energia del sistema e quindi la frequenza delle transizioni NMR. Tutte le
interazioni magnetiche generano sul nucleo un campo magnetico locale che si somma a
quello statico esterno e che varia casualmente nel tempo: se queste fluttuazioni avvengono
alla frequenza corrispondente alla transizione tra due stati del sistema di spin, il nucleo in
esame può scambiare energia e può avvenire una transizione. Ciascuna delle interazioni
che hanno queste caratteristiche costituisce dunque un potenziale meccanismo di
rilassamento che, dopo una perturbazione, può contribuire a riportare all’equilibrio la
magnetizzazione.
Si può introdurre una funzione che è indice della persistenza dell’interazione di uno spin
con i campi magnetici locali a cui è sottoposto; essa è denominata funzione di correlazione,
F(
L
,
C
), ed è così definita perché mette in relazione la velocità di rilassamento con il
quadrato dell’energia dell’interazione ed è funzione della frequenza di precessione di
Larmor e del tempo di correlazione
C
:
T
i
-1
= F(
L
,
C
) E
2
FT
t
38
Si può dimostrare che la funzione di correlazione ha un andamento di tipo esponenziale
( secondo exp(-t/
C
) ) e che la sua Trasformata di Fourier ( FT ) è rappresentata da una
curva lorentziana centrata sullo zero, che definisce l’intensità dei campi magnetici locali
fluttuanti ad una certa frequenza ( Figura 2.6 ).
J( ) = funzione di densità spettrale
C
-1
= Fast Motion Limit
Figura 2.6: Ottenimento della funzione di densità spettrale.
Il rapporto 1/
C
è definito Fast Motion Limit ( FML ) ed indica la frequenza limite alla
quale il reticolo può far rilassare il sistema di spin. Se la frequenza di Larmor del nucleo in
esame è minore del FML, i moti statistici del reticolo modulano il rilassamento del sistema.
Se, invece, la frequenza di Larmor è maggiore del FML, il nucleo non rilassa perché non
vede la fluttuazione del sistema.
I fenomeni che possono generare un B
L
fluttuante che può costituire un meccanismo di
rilassamento sono i seguenti:
interazione dipolare nucleare con altri spin nucleari presenti all’interno della
molecola o in altre molecole ( d.d. intra ed intermolecolare );
interazione dipolare paramagnetica con spin elettronici spaiati presenti all’interno
della molecola e in altre specie ( d.d. paramagnetica intra ed intermolecolare );
anisotropia del tensore di schermo ( “chemical shielding anisotropy”, c.s.a. );
interazione spin rotazionale dovuta all’accoppiamento tra momento magnetico
nucleare e momento angolare di rotazione della molecola ( s.r. );
interazioni con il gradiente di campo elettrico cui è soggetto il nucleo se questo ha
spin >1/2 ( meccanismo quadrupolare, q. );
interazioni scalari dovute ad un accoppiamento indiretto con una specie che ha vita
breve; comprendono sia i meccanismi paramagnetici scalari che meccanismi
nucleari scalari ( scalar coupling, s.c. ).
f(t)
< 1/
c
log
FT
log
t
J( ) J( )
39
Le costanti di velocità di rilassamento longitudinale o trasversale ( R
1
e R
2
) misurate
sperimentalmente sono la risultante del contributo di tutti i possibili meccanismi di
rilassamento:
R
i
= R
i
( d.d. ) + R
i
( para ) + R
i
( c.s.a. ) + R
i
( s.r. ) + R
i
(q. ) + R
i
( s.c. ) i = 1, 2
Tra questi verranno di seguito descritti i più importanti.
Rilassamento longitudinale dipolo- dipolo
Dato un sistema costituito da due nuclei diversi I ed S entrambi con spin 1/ 2 appartenenti
alla stessa molecola, i rispettivi dipoli magnetici interagiranno: l’andamento nel tempo
della magnetizzazione di I
z
, dopo una perturbazione della magnetizzazione di equilibrio I
0
,
può essere descritto utilizzando l’analisi di Solomon.
In sistemi omonucleari, l’espressione della velocità R
1
contiene tutti i contributi degli spin
interagenti con I che sono stati perturbati durante l’esperimento di rilassamento ( contributi
di “cross- relaxation” ). Ovviamente in un sistema reale uno spin non è soggetto ad
un’unica interazione dipolare; una semplificazione comunemente accettata consiste nel
considerare tutte le interazioni come indipendenti e caratterizzate da un unico
C
, cioè che
la velocità di rilassamento R
1
sia la somma dei contributi dovuti a ciascuna interazione.
L’efficacia del rilassamento longitudinale dipolare intramolecolare dipende quindi:
dalla natura del partner del rilassamento attraverso il rapporto giromagnetico
dalla distanza tra i due nuclei;
dalle densità spettrali.
I protoni, con il loro elevato sono la fonte di rilassamento dipolare più comunemente
diffusa ed efficace per la maggior parte degli isotopi a spin 1/ 2 nelle molecole.
Un elettrone spaiato è anch’esso un agente di rilassamento estremamente efficace, come si
può evincere dal successivo paragrafo inerente questo meccanismo di rilassamento.
Per le interazioni dipolari intramolecolari, il moto che causa le fluttuazioni del campo è il
moto rotazionale. E’ facile prevedere che molecole piccole in soluzioni a bassa viscosità si
riorientino velocemente e quindi abbiano corti
C
( ~ 10
-12
s ) e T
1
lunghi; al contrario
macromolecole o molecole in soluzioni più viscose avranno
C
più lunghi ( ~ 10
-10
s ) e T
1
più corti.
40
Rilassamento per anisotropia del tensore di schermo
Il nucleo posto nel campo magnetico esterno costante omogeneo B
0
è soggetto
all’interazione di Zeeman e ad un campo locale generato dai suoi elettroni che schermano
il nucleo stesso dal campo esterno. La distribuzione elettronica però, a meno che il nucleo
sia in un sito molecolare ad alta simmetria ( tetraedrica, ottaedrica o cubica ), non è
isotropa e dipende dall’orientazione della molecola rispetto a B
0
.
La rotazione della molecola in soluzione produce due effetti: il più importante è una
variazione dell’energia della transizione NMR, che è funzione dell’intorno chimico del
nucleo; il secondo è una fluttuazione del campo magnetico locale sperimentato dal nucleo
stesso che permette al nucleo di rilassare. La dipendenza di questo meccanismo di
rilassamento dal quadrato del campo B
0
consente di aumentarne l’efficacia operando ad alti
campi, e permette di renderlo dominante rispetto ad altri contributi.
La anisotropia del fattore di schermo può essere considerata un indice della direzionalità
della densità elettronica attorno ad un atomo: la disomogeneità della distribuzione
elettronica porta infatti ad un rilevante contributo del rilassamento via c.s.a., decisamente
elevato per i nuclei dei metalli di transizione.
Rilassamento per accoppiamento scalare
Il contributo di questo meccanismo diventa rilevante solo in particolari condizioni, in
quanto la costante di accoppiamento scalare è un paio di ordini di grandezza inferiore
rispetto a quella dipolare; quindi in generale il contributo è conseguentemente più piccolo
ed è osservabile quando altri meccanismi sono inefficienti.
L’efficacia del meccanismo s.c. dipende dal verificarsi contemporaneo di condizioni che
riguardano sia la differenza delle frequenze di Larmor dei due nuclei, sia il tempo di
correlazione, sia la costante di accoppiamento.
Rilassamento paramagnetico
La presenza di ioni paramagnetici in una soluzione determina notevoli effetti sulla
velocità di rilassamento dei nuclei del solvente. Infatti il meccanismo di rilassamento
paramagnetico, quando è presente, dà un contributo dominante al meccanismo di
rilassamento del nucleo in esame.
L'aggiunta di un soluto paramagnetico causa un incremento delle velocità di
rilassamento longitudinale e trasversale dei nuclei del solvente.
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