Descrizione fenotipica di linee cellulari di medulloblastoma geneticamente modificate

1 INTRODUZIONE 
1.1 Il Medulloblastoma 
1.1.1 Generalità 
Il medulloblastoma (MB) è il tumore cerebrale maligno più frequente nell’età 
[1]
pediatrica, con 350 nuovi casi diagnosticati ogni anno negli USA. Costituisce circa 
il 20% di tutti i tumori del sistema nervoso centrale nei bambini e quasi la metà delle 
[2,3]
neoplasie della fossa cranica posteriore, essendo il cervelletto la sede 
d’insorgenza del tumore (80% nel verme e 20% negli emisferi). I soggetti più colpiti 
6
sono bambini di età compresa tra 0 e 14 anni (insorgenza 1/10), con due picchi di 
[1]
incidenza uno tra i 3-4 anni e l’altro tra 8-9 anni. Nel 15% dei casi il tumore si 
presenta negli infanti di età inferiore a 1 anno e nel 30% dei casi la neoplasia si 
[4]
sviluppa al di sopra dei 10 anni, in età adulta ed addirittura nei pazienti anziani. Il 
MB è 1,75 volte più comune nei bambini caucasici rispetto a quelli di altre etnie ed è 
[1]
1,7 volte più frequente nei maschi che nelle femmine. Solitamente la neoplasia è 
sporadica, ma nel 10% dei casi una predisposizione genetica all’insorgenza del MB è 
associabile ad alcune sindromi familiari, come la sindrome di Turcot di tipo 2, la 
sindrome di Gorlin, la sindrome di Li-Fraumeni e la sindrome di Rubinstain 
[5,6] 
Taybi.La sindrome di Turcot di tipo 2 è associata a mutazioni nella linea 
germinale del gene oncosoppressore APC (Adenomatous Polyposis Coli), coinvolto 
nel sistema di trasduzione del segnale WNT (Wingless Type) ed è caratterizzata dalla 
presenza concomitante di Poliposi Adenomatosa Familiare (FAP) e di tumori 
[7,8]
cerebrali primitivi, tra cui il MB. 
La sindrome di Gorlin, definita anche sindrome dei nevi multipli basocellulari 
(NBCCS), è invece il risultato di una mutazione ereditaria nel recettore Patched 
(PTCH), appartenente al sistema di segnalazione Sonic Hedgehog (SHH) e si 
2 
presenta con carcinomi multipli a cellule basali (epiteliomi), cisti mandibolari 
multiple, anomalie vertebrali e del rachide (solitamente spina bifida) e calcificazioni 
[5,8]
della falx cerebri. 
La sindrome di Li-Fraumeni è causata da mutazioni ereditarie a livello del gene 
oncosoppressore p53; i familiari affetti da questa sindrome presentano un pattern di 
tumori abbastanza vario: si riscontrano, infatti, neoplasie multiple e di diverso tipo ad 
[5]
insorgenza precoce sia a livello del SNC, tra cui il MB, sia in altre sedi. 
La Sindrome di Rubinstein-Taybi è data da mutazioni a livello germinale a carico del 
gene cbp (CREB binding protein) e del gene p300, che codificano per delle HATs 
(Istone-Acetiltransferasi) che fungono da cofattori trascrizionali in diversi pathway 
coinvolti durante lo sviluppo, tra cui il WNT. La perdita di funzione (Loss of 
function) di tali HATs porta all’insorgenza di un quadro sintomatico tipico quale: 
bassa statura, facies caratteristica, particolari dismorfie (pollici e alluci larghi) e 
ritardo mentale severo. I pazienti affetti da questa sindrome presentano un elevato 
[9] 
rischio di insorgenza di neoplasie, tra cui il MB. 
Il MB ha un comportamento piuttosto aggressivo con una notevole tendenza a 
metastatizzare principalmente nel SNC, attraverso il liquido cefalorachidiano, ma 
anche in sedi extracerebrali a livello di ossa, midollo osseo, linfonodi, fegato e 
polmoni. Un terzo dei pazienti, alla diagnosi, presentano già metastasi nel SNC e un 
numero ridotto di pazienti manifesta metastasi extraneuronali; il 10% degli adulti e il 
30% dei bambini mostrano evidenze di espansioni tumorali al momento della 
[6,10] 
diagnosi. 
3 
1.1.2 Classificazione, istogenesi e varianti istopatologiche 
La WHO (World Health Organization) annovera il MB fra i tumori embrionali del 
SNC. Al momento, poter fare una classificazione più precisa risulta difficile a causa 
dell’incerta istogenesi del tumore. Si ipotizza che il MB derivi da cellule progenitrici 
neuroectodermiche, come le cellule della matrice subependimale, mentre altre ipotesi 
[9]
sostengono che il tumore si origini dalle cellule dello strato dei granuli esterni. Per 
molto tempo il MB è stato considerato fra i tumori neuroectodermici primitivi 
(Primitive Neuroectodermal Tumors, PNET) poiché le varianti desmoplastica e 
nodulare originano dalle cellule dello strato dei granuli esterni (External 
Granularcell Layer, EGL) del cervelletto e quindi hanno istogenesi assimilabile a 
[9,11,12] 
quella dei PNET. Tuttavia il MB si differenzia dai PNET per diverse 
caratteristiche, prima fra tutte la sede preferenziale d’insorgenza a livello cerebellare, 
rappresentata dalla zona infratettoriale nella fossa posteriore per il MB e dalla zona 
sopratettoriale per gli PNET. In questi tumori sono state inoltre identificate mutazioni 
oncogeniche diverse, che suggeriscono il coinvolgimento di pathway di segnalazione 
[13] 
differenti. Anche la risposta alla radioterapia (RT) e alla chemioterapia differisce 
[11,12]
nei due casi. La WHO quindi classifica il MB separatamente dai PNET. 
La classificazione della WHO distingue diverse varianti istopatologiche di MB: 
-MB classico: (80% dei casi) è caratterizzato da piccole cellule densamente stipate di 
forma rotondo-ellissoidale con un elevato rapporto nucleo/citoplasma e nuclei iper-
cromatici che possono presentare forma ovale o triangolare. Sono presenti, in misura 
variabile, foci di necrosi e angiogenesi. In meno del 40% dei casi sono presenti roset-
te neuroblastiche, considerate come segno di differenziazione, caratterizzate, dal 
punto di vista ultrastrutturale, da cellule differenziate in senso neuroblastico con pro-
lungamenti citoplasmatici di tipo neuritico, localmente adesi per la presenza di plac-
 4 
che specializzate di adesione intercellulare. Questa tipica architettura può essere in-
tervallata da cellule più indifferenziate; 
-MB desmoplastico/nodulare (D/N): (15% dei casi) caratterizzato dalla presenza di 
noduli, formati da cellule maggiormente differenziate in senso neurocitico, e da una 
desmoplasia internodulare. I noduli sono normalmente di forma rotonda e diffusi nel-
le regioni desmoplastiche costituite da cellule più indifferenziate con nuclei pleio-
morfi producenti collagene, il quale forma una sorta di matrice extracellulare dispo-
[14] 
sta intorno ai nodi; 
- MB ad estesa nodularità (MBEN): (<1% dei casi) composto da noduli formati da 
cellule maggiormente differenziate in senso neurocitico tipicamente larghi e con 
forma irregolare e da una desmopasia iternodulare che è scarsa ma chiaramente pre-
[14]
sente; 
- MB a grandi cellule/anaplastico (LCA): (4% dei casi) si caratterizza per la pre-
senza di grandi cellule con nuclei grandi e rotondi o pleiomorfi con nucleoli singoli e 
prominenti; in particolare un pleiomorfismo nucleare marcato e diverse atipie di for-
me cellulari concorrono a determinare il fenotipo anaplastico. Queste varianti del 
tumore presentano un elevato indice apoptotico e mitotico, estese aree di necrosi e 
[9,15,16]
scarsa coesività intercellulare. 
- MB con differenziamento melanocitico (MB melanocitico) e MB con differen-
ziamento miogenico (Medullomioblastoma): sono due forme estremamente rare 
del MB; in un primo momento considerate neoplasie cerebellari indipendenti sono 
attualmente annoverate nell’ambito delle diverse varianti di MB, in ragione di carat-
teri istopatologici, alterazioni genetiche e comportamento clinico comuni. Il MB me-
lanocitico si differenzia dalla variante classica solo per la presenza di melanina nelle 
5 
cellule. Queste possono organizzarsi in cluster e possono avere un aspetto indifferen-
ziato o assumere aspetto epitelioide ad architettura tubulare o papillare. Normalmente 
esprimono la proteina S-100. Il Medullomioblastoma presenta aspetti tipici del dif-
ferenziamento rabdomioblastico, quali la formazione di fibrille muscolari o la pre-
senza di cellule grandi, sparse, globulari con forte immunoreattività alla desmina, al-
la mioglobina, alla miosina. Si evidenziano caratteristiche rabdomioblastiche anche a 
[9,17]
livello ultrastrutturale. 
L’insieme di queste varianti di MB si configura come uno spettro continuo, seguendo 
un gradiente di differenziazione crescente, che parte dal MB a grandi cellule fino ad 
[13,18,19] 
arrivare al MB a estesa nodularità all’estremo opposto. La classificazione i-
stopatologica del MB risulta correla all’espressione di due oncogeni che fungono da 
fattori di trascrizione: OTX1 e OTX2 (orthodenticle 1 e 2). Tutti i MB esprimono 
OTX1, OTX2 o entrambi; in particolare è stato osservato che l’mRNA di OTX2 cor-
rela tipicamente con l’istotipo classico, mentre l’espressione del mRNA di OTX1, 
[20]
con assenza di OTX2, correla con la variante desmoplastica. 
Recentemente diversi lavori hanno proposto una differente classificazione del MB 
basandosi sulle caratteristiche genetiche, molecolari e cliniche. 
Infatti mediante l’integrazione di genome-wide DNA copy number and mRNA e-
[21]
xpression, sono così stati identificati quattro sottotipi molecolari : 
-Il sottotipo WNT, associato all’attivazione della cascata di segnalazione WNT e 
nel quale sono chiaramente identificati i bersagli del pathway (WIF1, DKK1 e 
DKK2) insieme ad alti livelli di espressione di MYC. E’ caratterizzato da monoso-
mia del cromosoma 6 e mostra una over-espressione per i pathway coinvolti nella 
axonal guidance. MB con sottotipo WNT sono istologicamente rappresentati dalla 
6 
forma classica e da quella a grandi cellule/anaplastico. Pazienti che presentono il sot-
[22]
totipo a grandi cellule/anaplastico hanno una prognosi più favorevole. Il sotto-
gruppo mostra un’uguale incidenza nelle diverse età. 
-Il sottotipo SHH, presente sia nella forma desmoplastica che a grandi cellu-
le/anaplastico del MB. Dal punto di vista molecolare è caratterizzato dall’attivazione 
del pathway WNT e dall’attivazione del pathway SHH, come confermato 
dall’espressione di HHIP, SFRP1 e MYCN. Risultano anche over-espressi i pathway 
implicati nella axonal guidance. In questo sottotipo sono stati inoltre rilevati la dele-
zione del 9q, l’acquisto del cromosoma 9p, 3p, 20q, 2 e 21q e perdita del 14 e 10q. 
La maggiore incidenza si ha nei bambini al di sotto dei 3 anni e negli adulti al di so-
pra dei 16 anni di età. 
-Il sottotipo C, riscontrato sia nella forma desmoplastica che a grandi cellu-
le/anaplastico del MB. È caratterizzato dall’elevata espressione dell’oncogene 
22,2324 
OTX2, FOXG1Be MYC, e dall’attivazione del pathway WNT. Sono inoltre i-
perespresse le catene di segnalazione mediate da fototrasducina e da glutammina, 
coinvolte nello sviluppo neuronale. Le più frequenti aberrazioni cromosomiche sono 
rappresentate da isocromosoma del 17q, acquisto del 1q, del 17q e del 18, perdita 
del distale 5q, del 8q, del 16q, del 10q e del 11p. Questo sottotipo presenta un picco 
di incidenza tra i 3 e i 10 anni mentre è completamente assente sopra ai 10 anni. La 
prognosi è fortemente negativa, data l’elevata tendenza di questo sottotipo a metasta-
tizzare. 
- Il sottotipo D, riscontrato sia nella forma desmoplastica che a grandi cellu-
le/anaplastico del MB. E’ il solo sottogruppo mancate dell’espressione della MYC 
22,23
family, mentre è caratterizzato da un’alta espressione dell’oncogene OTX2, 
24
FOXG1B e dall’attivazione del pathway WNT. Risultano over-espressi diversi pa-
 7 
thway coinvolti nello sviluppo neuronale, come semaforine, adenosina monofosfato 
ciclico, recettori accoppiati a proteine G e recettori β-adrenergici. Questo sottotipo è 
caratterizzato dalle seguenti aberrazioni cromosomiche: isocromosoma del 17q, ac-
quisto del 17q, del 18 e perdita del 11p, del 8p , del 8q e del cromosoma X nelle 
femmine. Il sottogruppo presenta un’uguale incidenza nelle diverse fasce di età. 
1.1.3 Clinica, attuale stratificazione del rischio e trattamento terapeutico 
I sintomi di un paziente affetto da MB sono correlati all’ipertensione endocranica che 
si manifesta con cefalea, vomito a getto, papilla da stasi e disturbi del 
comportamento, come irritabilità e apatia. Possono essere inoltre presenti 
[23] 
bradicardia, ipertensione e atassia. 
La diagnosi si effettua mediante Risonanza magnetica (MRI) cerebrale e spinale, che 
valuta inoltre l’eventuale presenza di metastasi (in particolare spinali, intradurali, 
[24]
extramidollari). 
La prognosi del paziente è legata a diversi fattori clinici tra cui l’età al momento 
[25]
della diagnosi, la presenza di metastasi e l’estensione dei residui post-operatori. 
Attualmente la stratificazione del rischio è effettuata mediante tali indicatori 
prognostici ed i pazienti vengono suddivisi in due gruppi di rischio: 
- Pazienti a medio rischio (circa 60-70% dei casi), di età superiore ai 3 anni con 
resezione totale o quasi totale della zona di insorgenza della malattia e assenza di 
[4]
metastasi al momento della diagnosi. Negli USA il minimo residuo tumorale 
2
corrisponde ad un residuo tumorale, dopo l’asportazione, minore di 1,5cm, mentre 
in Germania nel Pediatric Brain Group Trial (HIT-SKK) e nel protocollo 
[26]
chemioterapico HEAD START i pazienti per essere considerati a rischio medio 
non devono avere residui tumorali. 
8 
- Pazienti ad alto rischio, di età inferiore ai 3 anni con metastasi e/o tumore residuo 
2
>1.5cm. 
Il trattamento terapeutico consiste nell’asportazione chirurgica del tumore, dopo la 
quale nel paziente può insorgere la sindrome della fossa cranica posteriore, 
caratterizzata da alterazioni del comportamento, mutismo, ipotonia, atassia, 
instabilità emotiva, deficit che colpiscono i nervi cranici e il cervelletto, ed 
emiparesi. 
Nei pazienti a medio rischio, alla resezione chirurgica segue RT frazionata dell’intero 
asse cranio-spinale (23.4Gy), per rallentare la diffusione del tumore attraverso gli 
spazi sub-aracnoidei, e a livello della fossa cranica posteriore (54Gy). Il trattamento 
è completato da 12 mesi di chemioterapia. I pazienti ad alto rischio sono sottoposti 
ad irradiazione di 36 Gy a livello cranio-spinale e di 54 Gy a livello della fossa 
[19]
posteriore, seguite da chemioterapia. Dilazionare l’irradiazione in un discreto 
lasso di tempo ha portato notevoli migliorie sull’azione antitumorale del trattamento, 
poichè permette di raggiungere dosi cumulative più elevate rispetto alla singola 
applicazione. La RT, infatti, può avere notevoli effetti collaterali in quanto induce 
uno stress ossidativo, che può causare danneggiamento del tessuto sano circostante il 
tumore colpendo neuroni, oligodendrociti e cellule endoteliali. Lunghi trattamenti, 
soprattutto in pazienti molto piccoli, possono portare ad un declino delle funzioni 
psico-cognitive e sensoriali, e delle funzioni endocrine. Inoltre si può riscontrare un 
aumento del rischio di neoplasie secondarie dovute ai trattamenti radio e 
chemioterapici quali meningioma, astrocitoma, glioblastoma, fibrosarcoma, 
adenocarcinoma rettale, leucemia linfoblastica acuta e leiomiosarcoma ovarico. Si 
può riscontrare infine tossicità cardiaca, polmonare, in particolare Restrictive Lung 
[27] 
Desease (RLD), ematologica nonché alopecia e iperpigmentazione. 
9