Influenza della variabilità genetica sull'escrezione urinaria dei metaboliti del benzene

  
 
 
III
 
 
 
 
 
 
 
 
    L'esposizione a benzene è considerata una fonte di rischio per la salute umana, per 
la sua ben nota tossicità e cancerogenicità e data la sua presenza praticamente 
ubiquitaria come inquinante atmosferico. 
L'azione biologica del benzene è dovuta alla sua conversione in composti altamente 
reattivi che avviene all’interno dell’organismo ad opera degli enzimi del metabolismo. 
E' stata osservata una notevole variabilità nell’escrezione urinaria di metaboliti del 
benzene, quali acido trans,trans-muconico (TMA) ed acido S-fenilmercapturico 
(PMA), che vengono considerati come marcatori di esposizione al composto 
parentale. Tale variabilità non correla con i livelli di esposizione ambientale, rilevati 
con i campionatori a diffusione (Radiello), e, quindi, è stato ipotizzato che possa 
dipendere da caratteristiche individuali quali l'età, il sesso, la massa corporea, l'attività 
e la capacità metabolica. In particolare è noto che la capacità metabolica individuale 
può variare in relazione al polimorfismo genetico degli enzimi coinvolti nel 
metabolismo stesso. 
Obiettivo del nostro studio è stato quello di valutare se il polimorfismo di alcuni 
enzimi implicati nella bio-trasformazione del benzene possa rendere conto della 
variabilità nell'escrezione urinaria dei metaboliti del benzene riscontrata in un 
campione di soggetti esposti.  
Nell'ambito di un progetto di collaborazione multidisciplinare è stato selezionato un 
gruppo di 595 soggetti, di cui 87 lavoratori esposti professionalmente a benzene 
nell'industria chimica,  228 vigili urbani esposti professionalmente allo smog cittadino 
(Torino), 102 soggetti non esposti professionalmente, ma esposti volontariamente 
(fumatori> 10 sigarette/dì) e 178 soggetti non esposti professionalmente, suddivisi in 
26 addetti alla macelleria, 34 lavoratori in una industria casearia e 118 lavoratori di 
 
RIASSUNTO 
  
 
 
IV
una cartiera. Di ogni individuo è stata compilata una scheda anamnestica in cui sono 
riportati dati anagrafici quali sesso, età, peso, altezza, professione, anni di lavoro, 
abitudini di vita, fumo, residenza, dieta e patologie varie. Di ognuno è stato prelevato 
e analizzato un campione di urina per misurare la concentrazione dei metaboliti del 
benzene: TMA (acido trans,trans-muconico) e PMA (acido S-fenilmercapturico). 
Il nostro compito è stato quello di raccogliere un campione di sangue per ciascun 
soggetto, estrarne il DNA e utilizzarlo per la determinazione del genotipo per i geni 
GSTP1, GSTT1 e GSTM1, che codificano per tre isoforme delle glutatione-S-
transferasi e per i geni NQO1, MPO, che codificano rispettivamente per la 
NAD(P)H-quinone ossidoriduttasi e la mieloperossidasi. Tutti questi geni sono 
polimorfici e presentano alleli difettivi che possono essere responsabili di una ridotta 
capacità metabolica nella biotrasformazione del benzene. L'analisi del genotipo 
individuale è stata effettuata mediante tecniche di PCR e mediante la tecnologia 
TaqMan-Real Time PCR. Dai dati riscontrati in questa analisi è risultato che non si 
hanno influenze significative dei singoli polimorfismi sul metabolismo del benzene a 
così basse concentrazioni e che i fumatori mostrano valori di PMA maggiori rispetto 
alle altre categorie. Inoltre questo studio è stato un’occasione per mettere a punto un 
protocollo di PCR-Real Time col metodo TaqMan. 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
  
 
 
V
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
    The exposure to benzene is considered a source of risk for the human health due 
to its ubiquitary presence as atmospheric pollutant, its known toxicity and its 
carcinogenity. 
The biological effect of benzene takes place for its conversion in highly reactive 
metabolites inside the organism trought the action of metabolic enzymes. 
It was observed a notable variability  in the urinary excretion of benzene metabolites: 
trans,trans-muconic (TMA) acid and S-phenilmercapturic acid (PMA), that are 
considered the biological markers of benzene exposure. 
This variability is not correlated with the levels of environmental exposure (estimated 
with diffusive samplers Radiello), and so it was been supposed that it can depend 
from individual characteristics: age, sex, body mass, metabolic activities. 
Particularly it is known that the individual metabolic capacity can change in 
relationship with the genetic polymorphisms of the enzymes implicated in the same 
metabolism. 
The aim of our study was to evaluate if the polymorphism of some enzymes, related 
to the bio-conversion of benzene, can justify the variability in the urinary excretion 
of benzene compounds in a sample of exposed persons. 
In this multi-disciplinary project was selected a sample of 595 persons, (87 workers 
exposed to benzene in the chemistry farm, 228 traffic policemen exposed to the city 
traffic (Torino), 102 smokers (>10 cigarettes/day), and 178 persons not exposed: 26 
butchers, 34 workers in a dairy-farming and 118 workers in a paper mill). 
For every person was compiled a case-history containing: sex, age, weight, job, work-
period, life style, smoke habits, residence, diet and various diseases. 
ABSTRACT 
  
 
 
VI
A sample of urine was collected from each person to evaluate the concentration of 
benzene metabolites: TMA and PMA. 
Our task was to extract the DNA, taken from a blood sample, and to determinate the 
genotype for the GSTP1, GSTT1, GSTM1 genes that code three iso-forms of 
glutatione-S-transferases, and the NQO1 and MPO genes, that code respectively for 
the NAD(P)H-Quinone-oxidoreductases and the myeloperoxidases. 
All these genes are polymorphic and have some defective alleles responsible for a 
reduced metabolic capacity in the benzene bio-conversion. The analysis of the 
individual genotype was performed with PCR and TaqMan-Real Time PCR 
techniques. 
From our investigation appeared that at these very low exposure levels there is no 
significant influence, of single polymophisms affecting Benzene metabolism. 
Another evidence is that smokers have higher values for PMA compared to other 
persons. Moreover this study was an occasion to develop a protocol of PCR-Real 
Time with the TaqMan technique. 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
  
 
 
Fig. 1.1 Molecola del benzene, struttura di  F. A. Kekulè  
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
1.1 Il benzene 
    Il benzene (C6H6) è l’idrocarburo aromatico più semplice esistente in natura.  
E’ liquido a temperatura ambiente, incolore, gradevole all’olfatto, assai volatile ed 
infiammabile, ha una temperatura di ebollizione di 80,3°C e solidifica a 5,4°C, la sua 
densità è 0,89 gr/cm3. E’ scarsamente solubile in acqua (1,780 mg/l a 25°C), ma è 
miscibile con altri solventi organici quali alcool, cloroformio, acido acetico e 
tetracloruro di carbonio. Essendo altamente reattivo può andare incontro a rottura 
dell’anello aromatico, oppure a reazioni di addizione e sostituzione, con formazione 
di alogenati, nitrati, solforati e derivati alchilici (Fig. 1.1). 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
E’ largamente usato come solvente di molte sostanze organiche (gomme, resine, 
grassi, etc.), viene addizionato a miscele di carburanti (con benzina), ed inoltre viene 
impiegato come materia prima per la produzione di alcuni importanti composti 
INTRODUZIONE 
  
 
Influenza della variabilità genetica sull’escrezione urinaria dei metaboliti del benzene 
 
 
 
  
INTRODUZIONE 
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(etilbenzene, cicloesano, etc.) usati nella preparazione di materie plastiche, detergenti, 
fibre tessili, coloranti, etc. Ha anche azione antisettica, antiputrida, contro parassiti 
della pelle, ma il suo impiego terapeutico è estremamente limitato (Enc. Treccani). 
Il benzene si trova anche in materiali ricchi di carbone sottoposti a incompleta 
combustione, nel fumo di sigaretta e, in natura, è prodotto nelle eruzioni vulcaniche e 
negli incendi delle foreste, ma l’emissione antropogenica è senza dubbio la fonte 
maggiore. 
 
1.2 Diffusione ambientale del benzene 
    Attualmente il benzene rappresenta uno dei maggiori inquinanti ambientali. 
Nell’atmosfera è ubiquitario, è stato ritrovato in campioni di aria prelevati sia in 
ambienti urbani che rurali ed anche all’interno di ambienti chiusi (indoor). 
L’inalazione, infatti, rappresenta la principale fonte di esposizione umana (Hattemer-
Frey et al., 1990*).  
L’esposizione è maggiore per gli individui che professionalmente entrano in contatto 
con sostanze contenenti benzene, alcuni esempi sono rappresentati da pompieri, 
vigili urbani e lavoratori nelle industrie petrolchimiche e nelle industrie manifatturiere 
delle gomme, nei calzaturifici, nelle acciaierie, nelle tipografie. Un’altra fonte di 
esposizione molto importante è rappresentata dal fumo attivo di sigaretta, ma anche 
il fumo passivo rappresenta una fonte da non sottovalutare, come viene riportato in 
alcuni studi rivolti alla valutazione della concentrazione di benzene nelle abitazioni di 
fumatori e non (Wallance, 1989*). Per le persone che non entrano direttamente in 
contatto con il fumo attivo o passivo anche lo smog cittadino rappresentano una 
fonte importante di esposizione. 
L’assunzione di benzene da una sigaretta è di 30 µg, ed è stato calcolato che una 
persona che fuma due pacchetti di sigarette al giorno ha una assunzione aggiuntiva di 
benzene di 1200 µg rispetto all’assunzione ambientale (Fishbein, 1992*). 
Alcuni studi, effettuati dall’EPA (Environmental Protection Agency) tra il 1980 e 
1990, suggerirono che, per tante sostanze chimiche tra cui il benzene, le fonti più 
importanti di inquinamento sono ridotte e ristrette all’ambiente circoscritto alla 
persona e che l’esposizione chiaramente non è correlata all’emissione.  
  
 
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INTRODUZIONE 
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L’esposizione a benzene può avvenire anche per ingestione di cibi e/o acqua, o per 
esposizione dermica dovuta all’uso di oggetti contaminati, anche se per molte 
persone, questi livelli di esposizione sono trascurabili. L’acqua potabile contiene 
meno di 0,1 ppm di benzene, inoltre esso è stato ritrovato anche in acqua minerale, 
liquori e cibi vari, tra cui frutta, pesce, ortaggi, carne, noci ed uova (EPA, 1982e*). 
Soltanto una piccola quantità di questi cibi è stata analizzata quantitativamente: le 
uova contengono una concentrazione di benzene pari a 2100 ppm a crudo e 500-
1900 ppm cotte; le carni di agnello, di pecora, di vitello e di pollo (quando vengono 
cucinate) contengono meno di 10 ppm di benzene (EPA 1980b*, 1982e*). 
Fino agli anni quaranta, il benzene veniva ottenuto come sotto-prodotto del carbone 
nelle acciaierie. Dal 1950, con l’aumento della richiesta, specialmente per la crescita 
delle industrie plastiche, è stata necessaria la sua sintesi dal petrolio. Oggi la grande 
maggioranza di benzene viene prodotta dall’industria petrolchimica ed in minima 
parte dal carbone.  
Nella benzina il benzene aumenta il “numero di ottani” (riduce la detonazione 
anticipata), ciò ha portato ad un suo uso massiccio nei carburanti per autoveicoli. Dal 
1950 in poi, poiché tossico, venne sostituito dal piombo tetraetile, ma, in seguito, con 
l’eliminazione globale del piombo, il benzene è tornato a sostituirlo come additivo in 
molte nazioni tra cui l’Italia. 
Gli Stati Uniti, visti gli effetti negativi del benzene sulla salute, hanno imposto delle 
misure restrittive riguardo alla quantità dello stesso nelle benzine.  
La direttiva del Consiglio della CEE del 20 marzo 1985 (85/210/CEE), concernente 
il ravvicinamento delle legislazioni degli stati membri, relative al tenore di piombo 
nella benzina, dispose all'art. 4 primo comma che: ”a decorrere dal 1° ottobre 1989 il 
tenore di benzene della benzina contenente piombo e di quella priva di piombo non 
deve superare il 5% in volume”. 
In Italia la Legge ordinaria del Parlamento n° 413 del 04/11/1997 riguardante le 
misure urgenti per la prevenzione dell'inquinamento atmosferico da benzene, 
stabilisce all’art. 1 che: “a decorrere dal 1° luglio 1998, il tenore massimo consentito 
di benzene e di idrocarburi aromatici totali nelle benzine è fissato, rispettivamente, 
nell'1% in volume e nel 40% in volume”. 
 
  
 
Influenza della variabilità genetica sull’escrezione urinaria dei metaboliti del benzene 
 
 
 
  
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1.3 Effetti biologici del benzene 
1.3.1 Effetti valutati su persone e su colture di cellule umane  
    Gli organi principalmente coinvolti ad esposizione a benzene sono i polmoni, lo 
stomaco e l’intestino. Dalla pelle una piccola quantità di benzene può arrivare nel 
flusso sanguigno e da lì attraversare tutto l’organismo arrivando al cervello, al midollo 
osseo e al fegato, dove viene trasformato nei suoi principali metaboliti. Si pensa che 
alcuni degli effetti nocivi di questa sostanza siano causati da questi metaboliti. 
Tipicamente la maggior parte di essi lascia l’organismo attraverso l’urina dopo circa 
48h dall’esposizione. 
Casi di morte dovuti ad esposizione a benzene sono riportati in letteratura già dai 
primi anni del 1900; un’esposizione per 5-10 minuti ad una concentrazione di 
benzene di 20.000 ppm è fatale (Flury., 1928*).  
Tra le varie cause di morte, il cancro fu associato ad esposizione cronica a benzene 
(Li et al., 1994*). Gli effetti cancerogeni e tossici dell’esposizione a benzene 
riguardano soprattutto il sistema ematopoietico. Nel midollo osseo la tossicità del 
benzene, infatti, può condurre a varie forme di malattia del sangue, causando 
progressive leucocitopenie (riduzione dei globuli bianchi), anemie (riduzione di 
emoglobina nel sangue), trombocitopenie (riduzione del numero di piastrine nel 
sangue) e pancitopenie (riduzione globale di tutti gli elementi del sangue) (D. W. 
Nebert et al., 2002).  
Varie forme di leucemia conosciute come sindrome mielodisplastica (MDS) sono 
state associate ad esposizione a benzene. Tale sigla comprende la leucemia 
mieloblastica acuta (AML), la leucemia acuta non-linfocitaria (ANLL) e la leucemia 
linfocitaria acuta (ALL).  
La tossicità e la malignità ematologiche non sono l’unico effetto associato ad 
esposizione a benzene. Sembra che possa aumentare il rischio di cancro nelle cellule 
renali e di carcinoma nelle cellule uroteliali ed anche il rischio di tumore al polmone, 
soprattutto per i fumatori (D. W. Nebert et al., 2002).  
Sono stati proposti quattro meccanismi per spiegare gli effetti genotossici del 
benzene: la formazione di addotti al DNA e di legami crociati, danni ossidativi al 
  
 
Influenza della variabilità genetica sull’escrezione urinaria dei metaboliti del benzene 
 
 
 
  
INTRODUZIONE 
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DNA, danni ai componenti dell’apparato mitotico o l’inibizione della topoisomerasi 
II ( J. Whysner et al., 2004). 
Aberrazioni cromosomiche sia numeriche che strutturali sono state ritrovate nel 
midollo osseo di lavoratori professionalmente esposti a benzene. La conclusione che 
il benzene rappresenti una sostanza potenzialmente clastogena per l’uomo è stato 
riportata da studi effettuati sia in vivo che in vitro. I linfociti periferici e il midollo 
osseo sembrano essere i principali bersagli. Uno studio epidemiologico effettuato su 
persone professionalmente esposte riportò effetti non casuali sui cromosomi uno, 
due, quattro e nove (Sasiadek et al., 1989*). Tale studio però era limitato in quanto i 
soggetti di controllo erano numericamente pochi e tutti i partecipanti erano anche 
fumatori. Esperimenti in vitro hanno mostrato che anche i metaboliti del benzene, 
come la trans,trans muconaldeide, possono aumentare in modo significativo lo 
scambio tra cromatidi fratelli (Witz at al., 1990*). Rottura cromosomica ed 
iperdiploidia furono trovate in seguito nell’esposizione di linfociti ad idrochinone 
(Eastmond et al., 1994*). I metaboliti del benzene quali fenolo, idrochinone, catecolo 
e benzene triolo, inducono micronuclei sia in vivo che in vitro.  
 
1.3.2 Effetti valutati su animali da laboratorio 
    Saggi effettuati per valutare la presenza di micronuclei hanno riportato 
un’aumentata frequenza correlata all’esposizione a benzene anche in animali, in 
particolare nei topi. 
Lo scambio tra cromatidi fratelli è stato visto in studi su topi e ratti esposti a benzene 
(Erexon et al., 1986*; Sharma et al., 1985*; Tice et al.,1980-1982*). I topi maschio 
mostravano un maggiore incremento nella frequenza di aberrazione cromosomica ed 
un aumento dei micronuclei rispetto a quelli femmina (Barale et al., 1985*; Choy et 
al., 1985*; Tiranni et al., 1988*). 
 
Oggi il benzene è stato classificato come cancerogeno umano di gruppo 1 (quelle 
sostanze con sufficienti evidenze di cancerogenicità nell’uomo) dall’Agenzia 
Internazionale per la Ricerca sul Cancro (IARC).