Riassunto
I
RIASSUNTO
Il progetto di dottorato è stato condotto nel Laboratorio di Proteomica del Dipartimento
di Biotecnologie dell‟Università di Verona. Per la stesura di tale progetto sono state
instaurate collaborazioni con alcuni laboratori, sia interni allo stesso Dipartimento sia
appartenenti ad altre Università o Istituti di Ricerca. In particolare, per quanto riguarda
lo studio su cellule di cancro colorettale trattate con un nuovo chemiofarmaco, il
Laboratorio del Prof. Zunino (Fondazione IRCCS, Istituto Nazionale dei Tumori, Milano)
ha fornito tutti i campioni biologici, mentre il gruppo del Prof. Marengo (Dipartimento di
Scienze dell‟Ambiente e della Vita, Università degli Studi del Piemonte Orientale,
Alessandria) ha effettuato l‟analisi statistica multivariata dei dati.
Per quanto riguarda invece la caratterizzazione microbiologica, biochimica e proteomica
del ceppo tannasi-positivo VP08 di Lactobacillus plantarum, il lavoro è stato condotto in
collaborazione con il Dottor Zapparoli (Laboratorio di Microbiologia, Dipartimento di
Biotecnologie, Università di Verona).
L‟indagine proteomica su campioni di foglie di Vitis vinifera suscettibile a Plasmopara
viticola è stata realizzata in collaborazione col gruppo della Dottoressa Polverari
(Laboratorio di Biotecnologie Fitopatologiche, Dipartimento di Biotecnologie, Università
di Verona).
Infine, il gruppo del Prof. Zolla (Laboratorio di Proteomica, Dipartimento di Scienze
Ambientali, Università degli Studi della Tuscia, Viterbo) ha effettuato le analisi di
spettrometria di massa per l‟identificazione delle proteine di interesse individuate nei
diversi studi. Ulteriori analisi di massa sono state svolte, in parte, presso il medesimo
Laboratorio di Proteomica del Dipartimento di Biotecnologie dell‟Università di Verona e,
in parte, presso il Laboratorio di Proteomica del Dottor Vindigni (Centro Internazionale
di Ingegneria Genetica e Biotecnologia “ICGEB”, Trieste).
In questo progetto di dottorato sono stati applicati i metodi classici della proteomica
comparativa basata sull‟elettroforesi bidimensionale per l‟analisi di campioni umani,
microbici e vegetali legati a tre differenti problematiche, riguardanti rispettivamente:
Riassunto
II
1) la risposta di una linea cellulare di cancro al colon-retto ad un nuovo tipo di inibitore
delle istone deacetilasi
2) l’effetto dell’acido tannico sul microrganismo del vino Lactobacillus plantarum in
condizioni di carenza di nutrienti
3) i cambiamenti nel proteoma di foglia di Vitis vinifera cultivar Pinot Noir a diversi tempi
dopo infezione con Plasmopara viticola
Per quanto riguarda la prima parte del progetto, l‟attenzione è stata focalizzata su una
linea cellulare tumorale di cancro colorettale (CRC). Il CRC è uno dei più comuni tumori
maligni, che fa contare almeno un milione di nuovi casi in tutto il mondo e porta a più di
500000 morti ogni anno. Circa la metà dei pazienti con cancro del colon-retto sviluppa
metastasi durante il decorso della malattia. Come tutti i tumori, il CRC risulta essere il
risultato di eventi genetici ed epigenetici. Per quanto riguarda le alterazioni
epigenetiche, è noto che l‟ipoacetilazione degli istoni causa una repressione
trascrizionale. L‟acetilazione/deacetilazione degli istoni è controllata dall‟azione degli
enzimi istone-acetil-trasferasi (HAT) e istone-deacetilasi (HDAC). Per questa ragione, è
stato proposta la modulazione della repressione genica a livello epigenetico come un
approccio interessante per il controllo della crescita della massa tumorale e le HDAC
sono riconosciuti come potenziali target per questo approccio. Lo scopo di questa parte
di progetto di dottorato è stato investigare l‟effetto molecolare di un inibitore delle HDAC
ad ampio spettro (l‟RC307) sul profilo proteico della linea cellulare HCT116 di CRC. Le
cellule della linea HCT116 sono state messe in coltura con e senza RC307 e sono stati
settati i protocolli per estrarre le proteine sia dei lisati totali, sia degli estratti nucleari.
Mediante elettroforesi bidimensionale dei campioni proteici e l‟analisi delle immagini
tramite il software PDQuest è stato possibile individuare, dopo il trattamento con il
farmaco, un totale di 48 e 46 proteine differenzialmente espresse, nei lisati totali e negli
estratti nucleari rispettivamente. L‟identificazione mediante spettrometria di massa
nanoHPLC-ESI-IT e MALDI-TOF-TOF ha rivelato che tra le proteine modulate molte
sono correlate a vari processi cellulari che coinvolgono ad esempio la proliferazione, il
ciclo cellulare e la regolazione apoptotica, l‟espressione genica e l‟organizzazione della
cromatina e del citoscheletro e alcune delle variazioni più interessanti sono state
validate mediante western blot. Nel complesso questo lavoro ha permesso di
Riassunto
III
dimostrare come l‟inibitore delle HDAC RC307 sia efficace contro la crescita e lo
sviluppo del cancro al colon-retto. Il farmaco regola la repressione genica in modo
epigenetico, portando all‟inibizione della proliferazione cellulare e alla morte per
apoptosi mediante la regolazione di proteine chiave nella regolazione di questi processi.
Per verificare la veridicità dei risultati ottenuti dal confronto dei profili proteici effettuato
con il PDQuest, si è infine proceduto con l‟analisi multivariata degli stessi set di dati di
lisati e nuclei mediante un tipo di analisi statistica multivariata, il Partial Least Squares –
Discriminant Analysis (BE PLS-DA). Questa ulteriore analisi ha permesso di validare i
dati ottenuti tramite lo studio al PDQuest, ricavando informazioni aggiuntive. Infatti il
confronto tra i due tipi di analisi ha messo in luce che l‟analisi differenziale mediante il t-
test (utilizzato dal PDQuest) identifica un sotto-insieme degli spot significativi identificati
dalla BE PLS-DA, che risulta essere un metodo statistico più robusto in grado di
individuare variazioni tra loro correlate.
La seconda parte della tesi riguarda la caratterizzazione microbiologica, biochimica e
proteomica del ceppo tannasi positivo VP08 di Lactobacillus plantarum. I tannini
vegetali sono presenti nel suolo, nelle derrate alimentari e, come conseguenza, nei tratti
digerenti degli uomini e degli animali. L‟acido tannico (TA), un tannino idrolizzabile, ha
un effetto inibitorio sulla crescita di alcuni batteri, compresi i batteri lattici (LAB). Alcuni
batteri sono in grado di degradare i tannini grazie alla produzione dell‟enzima tannin
acyl idrolasi, comunemente chiamata tannasi. Tra le specie di LAB di interesse
enologico, l‟unica che risulta essere tannasi-positiva è L. plantarum. In questa parte del
progetto di dottorato, è stato indagato l‟effetto fisiologico e molecolare dell‟acido tannico
sul ceppo del vino tannasi-positvo di L. plantarum VP08, mediante saggi enzimatici e di
crescita e mediante l‟analisi proteomica differenziale del batterio cresciuto in presenza e
assenza di TA. Le cellule cresciute in presenza di TA hanno mostrato una maggiore
attività della enzima tannasi rispetto a quelle cresciute in glucosio. Le analisi cinetiche
di crescita hanno inoltre dimostrato che in presenza di TA la popolazione cellulare
rimane in fase stazionaria più a lungo rispetto alle cellule cresciute in glucosio e che,
anche in presenza di un‟alta concentrazione di tannini, la popolazione cellulare riesce
ad adattarsi (possibilmente per effetto dell‟induzione della tannasi), portando
successivamente ad un incremento della probabilità di sopravvivenza. É stata quindi
Riassunto
IV
effettuata un‟analisi proteomica comparativa mediante 2D-PAGE per individuare come
si esplicita a livello molecolare l‟aumento di sopravvivenza indotto dal TA. L‟analisi al
PDQuest delle immagini delle mappe proteiche ha permesso di individuare un totale di
36 spot differenzialmente espresse (di cui 15 sotto-espresse e 21 sovra-espresse) nel
campione di cellule cresciute in presenza di TA rispetto alle cellule cresciute in glucosio.
Le proteine identificate mediante analisi di spettrometria di massa sono risultate essere
coinvolte nella glicolisi, nel metabolismo degli aminoacidi, nella traduzione e nel
ripiegamento delle proteine. I risultati suggeriscono come la presenza di TA non porti ad
un cambiamento globale a livello di espressione proteica nelle cellule batteriche, ma
piuttosto alteri il livello di un numero relativamente basso di proteine appartenenti ad
importanti processi cellulari e metabolici. Ad esempio, interessante da notare è il fatto
che tutti gli enzimi coinvolti nel processo glicolitico risultano aumentati. Questo può
indicare che il ceppo tannasi-positivo VP08 di L. plantarum, in carenza di nutrienti, è in
grado di aumentare la sua sopravvivenza ottenendo energia supplementare mediante
l‟idrolisi tannasi-dipendente dell‟acido tannico nei monomeri costitutivi (acido gallico e
glucosio) e mediante la successiva sovra-espressione di enzimi glicolitici. Inoltre i dati
mostrano che nelle cellule cresciute in TA vi è una sovra-regolazione di proteine
coinvolte nella sintesi proteica e di alcune delle proteine che partecipano al corretto
ripiegamento delle proteine e alla degradazione di quelle instabili. È possibile quindi
inferire che le cellule cresciute in presenza di TA siano caratterizzate da un‟aumentata
attività del macchinario di ripiegamento e turn-over delle proteine, in grado di
permettere l‟adattamento alle condizioni di stress da carenza di nutrienti e una
maggiore capacità di sopravvivenza. In conclusione questo studio ha permesso per la
prima volta di indagare i meccanismi molecolari coinvolti nel rallentamento della crescita
cellulare e nell‟allungamento della sopravvivenza indotti dal TA in cellule di L. plantarum
in condizioni di carenza di nutrienti, quali sono quelle che possono presentarsi
naturalmente nel vino.
L‟ultima parte del progetto di dottorato ha riguardato lo studio del proteoma di foglia di
Vitis vinifera cultivar Pinot Noir a diversi tempi dopo infezione con Plasmopara viticola.
La peronospora è una delle più gravi patologie della vite coltivata e ancora oggi
rappresenta la malattia più distruttiva in Europa e negli Stati Uniti orientali. P. viticola,
Riassunto
V
l‟agente causale della malattia, colpisce tutti gli organi verdi della pianta che presentano
gli stomi e in condizioni climatiche favorevoli ed in assenza di misure di controllo può
causare una distruzione del 50-75% del raccolto stagionale. D‟altra parte la
peronospora comporta un alto impatto ambientale, a causa del continuo impiego di
fungicidi che continua tuttora. Per investigare l‟effetto molecolare dell‟infezione di
Plasmopara viticola sul profilo proteico della cultivar suscettibile Pinot Noir sono quindi
state messe a punto le condizioni di estrazione e di preparazione delle proteine da
tessuti fogliari e sono state ottenute le mappe 2D dei campioni dopo 24, 48 e 96 ore
dall‟inoculazione col patogeno e dei rispettivi controlli trattati con acqua. L‟analisi al
PDQuest ha permesso di rivelare 53, 14 e 47 proteine differenzialmente espresse,
rispettivamente a 24h, 48h e 96h dopo l‟infezione. Tramite l‟analisi di spettrometria di
massa, sono stati identificati in totale 72 diversi polipeptidi. Le proteine regolate
dall‟infezione del patogeno che sono state identificate, risultano essere correlate a vari
processi cellulari che coinvolgono ad esempio la fotosintesi e il metabolismo primario, la
risposta a stimoli e di difesa, la regolazione del potenziale redox e del ripiegamento
delle proteine. In particolare, è stato dimostrato che il patogeno porta ad una generale
sotto-espressione delle proteine coinvolte nei processi di fotosintesi e ad un
concomitante aumento nell‟espressione degli enzimi correlati con il metabolismo dei
carboidrati, in accordo con precedenti studi di trascrittomica condotti nel laboratorio di
Biotecnologie Fitopatologiche della Dott.ssa Polverari. Nel complesso, questi dati,
assieme a quelli che potranno essere raccolti dall‟analisi su campioni di una cultivar
resistente, possono permettere di delineare una strategia per l‟ingegnerizzazione di
piante di vite, al fine di renderle in grado di difendersi efficacemente dalla malattia.
Concludendo, tutti gli studi di analisi proteomica comparativa, effettuati durante questo
progetto di dottorato, confermano che l‟elettroforesi bidimensionale, accoppiata
all‟analisi tramite spettrometria di massa, è una tecnica efficace ed universale per
l‟analisi globale della variazione dell‟espressione proteica e per lo studio e la
comprensione dei meccanismi molecolari che stanno alla base di importanti processi di
interesse biomedico, economico ed ambientale.
Preface
VI
PREFACE
The proteome of a cell or an organelle provides information about the ensemble of
proteins and protein isoforms expressed in that cell or organelle under specific
physiological conditions and at a specific time. Proteomic approaches provide several
novel possibilities to address biological questions. In fact, the large-scale screening
approach of proteomics enables protein expression studies that are impossible to
perform using classical molecular biology and biochemical techniques, in which the
expression of only one or a few proteins is studied at a time. Instead, proteomic
techniques allow for the analysis of up to thousands of proteins simultaneously, in any
tissue or organelle, under any given physiological condition. Thus, proteomic
applications are growing in many areas of research and proteomic approaches are
nowadays widely exploited for cancer, microbial, and plant investigations.
The present work was focused on three proteomics studies:
1) evaluation of the cell response to a novel histone deacetylase inhibitor in colon
cancer cell
2) effect of tannic acid on lactobacillus plantarum wine strain during starvation
3) analysis of grapevine leaves after Plasmopara viticola infection
The thesis work was conducted at the Proteomics Laboratory of the Biotechnology
Department of the University of Verona, in collaboration with other laboratories:
concerning the study on colorectal cancer cells, the Laboratory of Oncology of the
IRCCS Foundation “Istituto Nazionale dei Tumori”, Milan, provided all the biological
samples, whilst the multivariate analysis of protein profiles was possible thanks to the
collaboration with the Department of Environmental and Life Sciences of the University
of Eastern Piedmont, Alessandria.
The biochemical and proteomic analysis of lactobacillus plantarum wine strain was the
result of the collaboration with laboratory of Dr. Zapparoli (Department of Biotechnology
of the University of Verona).
Proteomic investigations on the Grapevine leaves infected by Plasmopara viticola were
performed in collaboration with laboratory of Dr. Polverari (Department of
Biotechnology of the University of Verona).
Preface
VII
Finally, the identification of proteins for all the proteomic analyses performed were
possible thanks to the collaboration with the Proteomics laboratories of Department of
Environmental Sciences, Tuscia University, Viterbo, and of International Centre for
Genetic Engineering and Biotechnology, Trieste.
The results thus obtained are here discussed and evaluated.
Chapter 1
1
CHAPTER 1
TOOLS AND APPLICATIONS
OF PROTEOMICS
1.1 GENERAL INTRODUCTION
The terms proteomics and proteome were coined by Marc Wilkins and colleagues in the
early 1990s, and have then been adopted by the research community at large. The
proteome term refers to the full complement of proteins encoded by the genome of an
organism [1, 2]. Biochemical studies of protein activity have historically focused on the
analyses of single molecular species. The rapid discovery of new gene products, via
large-scale genomic initiatives, has necessitated the development of alternative
strategies to evaluate protein function. The challenge in recent years has been to
develop high-throughput approaches to facilitate systematic protein analysis of
biological samples, map functional interactions between proteins on a global scale, and
place them in a biological context.
To really understand biological processes, we need to understand how proteins function
in and around cells since they are the functioning units. Proteomics, the science that
studies the proteome, includes not only the identification and quantification of proteins,
but also the determination of their localization, modifications, interactions, activities,
and, ultimately, their function. Cells express genes encoding proteins with unique, cell-
specific functions in addition to proteins that carry out generic, yet essential functions.
Approximately 200 different post-translational modifications (PTMs) have been
reported, encompassing a wide variety of reversible and irreversible chemical reactions,
which influence the diversity, affinity, function, cellular abundance and transport of
proteins. The proteome comprises all of these forms, which makes its analysis
incredibly complex, as any protein may be present in a cell, in any form, at any given
time. As a consequence, every organism possesses one genome and multiple
proteomes. Proteomes are constantly changing in response to environmental stimuli,
chemicals and drug treatments, as well as growth and disease processes [3]. Many of
these changes hold considerable interest for researchers seeking to understand
Chapter 1
2
complicated disease pathologies, such as cancer. As the messenger RNA abundance
in a cell often poorly correlates with the amount of proteins synthesized, the proteome,
rather than the transcriptome, holds promise for the identification of novel therapeutic
targets. While proteomics initially encompassed just two-dimensional (2-D) gel
electrophoresis for protein separation and identification, now it refers to any procedure
that characterizes large sets of proteins. The explosive growth of this field is driven by
multiple forces: genomics and revelation of more and more new gene products;
powerful protein technologies, (such as newly developed mass spectrometry
approaches, global yeast two-hybrid techniques, and spin-offs from DNA arrays); and
innovative computational tools and methods to process, analyze, and interpret
prodigious amounts of data.
1.2 SAMPLE PREPARATION AND PROTEIN EXTRACTION
1.2.1 SOURCE OF SAMPLES
Tissues, cell lines, primary cell cultures and body fluids (such as plasma or
cerebrospinal fluid (CSF)) can be used as protein source. Different branches of
proteomics are also devoted to plant, bacteria and virus proteins. Anyway,
independently from the experimental model, sample preparation is a matter of great
importance, especially in comparative proteomics. Thus, not only an appropriate
experimental model, but also an optimized protein extraction protocol, have to be
carefully considered to obtain reliable results.
1.2.1.1 Animals
When a particular animal model has been established, usually the tissue connected
with a particular disease is chosen for detailed analysis. It‟s obvious that every tissue
has its own characteristics and has to be handled properly for protein extraction. During
tissue preparation for proteomic analysis, it is important to diminish its heterogeneity, as
much as it is possible. The sample should be pure and relevant. For example, in case of
cancer proteome analysis, it should be free of stroma, blood, serum, etc.. Fresh tissue
Chapter 1
3
should be free from connective tissue and fat. Biopsy might be another source of
samples for proteomics analysis. It seems to reflect the state of living organism, and
sometimes, collected material could be cultured for further experiments. On the
contrary, simplification of the sample is one of the greatest advantages of cell culture
serving as experimental model, especially in proteomics. This model allows for studying
the behaviour of a single type of cell in the absence of the complexity of the entire
tissue. This may help to reveal changes in low abundance proteins, which could be
impossible in the whole tissue study. Body fluids are another important source providing
vital information on the function of living organisms. Body fluids (such as blood, CSF,
urine, and saliva) are relatively easily available; thus they are commonly used for clinical
diagnosis. Anyway, great difficulties are associated with the broad dynamic range of
components present in body fluids [4].
1.2.1.2 Bacteria
Concerning bacterial samples preparation, problems can arise in disrupting cells, due to
the presence of thick cell walls and polysaccharide capsule in certain bacterial groups
[5]. Some bacteria could simply be lysed by the constituents of the lysis buffer (reducing
agents and detergents), but others must be disrupted mechanically (e.g. by sonication).
Sometimes, removal of the cell wall by enzymatic digestion is necessary.
1.2.1.3 Plants
A characteristic of plant cell is the presence of cell wall, mostly made up of cellulose and
its derivatives. Generally, disruption of cell wall and protein releasing are crucial for
analytical success [6]. Another specific feature of plant proteome analysis is the
presence of non-proteinaceous contaminants specific of plants (such as polyphenols,
lipids, organic acids, terpenes or pigments [7]) that can interfere with separation
methods. Therefore, removal procedures by protein precipitation are desirable; for
instance, acetone or 10% trichloroacetic acid in acetone are the most frequently used.
Chapter 1
4
1.2.2 METHODS OF CELL DISRUPTION
The first step in sample preparation for proteomic analysis is cell disruption. One of the
simplest method is homogenization that helps to break down the initial sample, to finer
particles in the nano- to micro-meter scale, so that target molecules, such as proteins,
can be released from the tissue for further processing. Ultrasonic homogenizers (also
called disintegrators), are based on the piezoelectric effect. Alternatively, pressure
homogenizers (such as French press) are an effective system for homogenization of
eukaryotic, as well as microbial and plant cells in suspension. In addition, French press
is often applied for the preparation of cell membranes for further experiments. Finally,
osmotic lysis methods utilize osmotic pressure to destroy cell walls and membranes.
Detergents are also efficient for cell disruption and extraction of nuclear and
mitochondrial membranes. The most commonly applied detergents are Triton X-100,
Tween 80, Nonidet P-40 (NP 40) and saponin.
1.2.3 PROTEIN SOLUBILIZATION
Protein solubilization strongly affects the quality of final results and thus determines the
success of the entire experiment. Once isolated, proteins are often insoluble in their
native state. To avoid protein modifications, aggregation or precipitation (resulting in the
occurrence of artefacts and subsequent protein loss), sample solubilization implicates
the use of chaotropes, detergents, reducing agents and protease inhibitors.
Usually, a neutral chaotropic agent, urea, is used at high concentrations ranging from 5
to 9M to effectively disrupt secondary protein structure. As indicated by Rabilloud et al.
[8], addition of thiourea to the denaturing solution containing urea, allows for substantial
improvement of protein solubility. Addition of thiourea to the sample buffer decreases
solubilization of urea. Therefore, when combined with 2M thiourea, urea concentration
should not exceed 5–7M [9].
Detergents and amphipathic molecules enable protein extraction and solubilization. It
has already been reported the great solubilizing power of zwitterionic detergents [10,
11], in addition it has been proved that non-ionic detergents are also efficient [12, 13].
Nowadays, sulfobetaine 3-[(3-cholamidopropyl)dimethylammonio]-1-propanesulfonate
(CHAPS) is most commonly applied in proteomic studies due to its high solubility and a
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