Sviluppo e applicazione di metodiche per il dosaggio plasmatico degli antibiotici linezolid e vancomicina mediante HPLC

2. INTRODUZIONE 
2.1 Classi di farmaci antibatterici. 
Gli antibiotici sono metaboliti prodotti da microorganismi che, a piccole dosi, inibiscono la crescita 
(batteriostatici) e la sopravvivenza (battericidi) di altri microorganismi senza causare eccessiva tossicità 
nell’organismo ospite. Oltre agli antibiotici veri e propri, molecole di origine naturale, si sono andati 
sviluppando negli anni composti di origine sintetica. 
Un tempo si impiegava la distinzione fra antibiotici a spettro limitato e ad ampio spettro, ma in seguito alla 
comparsa di ceppi batterici resistenti ad un farmaco o a più di uno, è ora preferibile una classificazione in base al 
sito bersaglio nella cellula ospite. Si distinguono quattro principali classi di farmaci antibatterici, gli inibitori 
della sintesi della parete cellulare, gli inibitori della sintesi proteica, gli inibitori della sintesi degli acidi nucleici 
e gli antimetaboliti. 
Di seguito riporto una breve descrizione di queste classi di farmaci, con i principali composti che vi 
appartengono, il meccanismo d’azione e lo spettro di attività. 
2.1.a Inibitori della sintesi della parete cellulare. 
L’interferenza con la sintesi della parete batterica è di gran lunga il meccanismo di azione più comune 
nell’ambito dell’attività degli antibiotici. Il primo gruppo di antibiotici classificato tra gli inibitori della sintesi 
della parete cellulare è quello dei β-lattamici. La principale componente strutturale della parete delle cellule 
batteriche è lo strato di peptidoglicano. E’ costituito da catene di 10-65 residui disaccaridici formati da molecole 
alternate di N-acetilglucosammina ed acido N-acetilmuramico. Queste catene sono legate da ponti peptidici in 
grado di creare un rivestimento rigido che avvolge il batterio e la formazione sia delle catene che dei legami 
crociati è catalizzata da enzimi regolatori specifici (es. transpeptidasi, carbossipeptidasi, endopeptidasi) detti 
proteine leganti la penicillina (PBP) in quanto si legano covalentemente agli antibiotici β-lattamici. Quando i 
batteri in attiva replicazione sono esposti a questi antibiotici, l’antibiotico si lega a specifiche PBP presenti sulla 
membrana citoplasmatica del batterio, inibendo la formazione dei legami crociati e portando di conseguenza 
all’attivazione di autolisine che degradano la parete cellulare causando la morte per lisi della cellula batterica. Al 
gruppo degli antibiotici β-lattamici appartengono le penicilline, le cefalosporine e cefamicine, i carbapenemi e i 
monobattamici. Le penicilline sono antibiotici molto efficaci, con una tossicità estremamente bassa. Il composto 
base è un acido organico con un anello β-lattamico ottenuto dalla coltura della muffa Penicillium chrysogenum. 
Se la muffa cresce con un processo di fermentazione vengono prodotte grandi quantità di un intermedio chiave, 
l’acido 6-amminopenicillamico in cui l’anello β-lattamico è fuso con l’anello tiazolinico. La sostituzione chimica 
di questo intermedio produce derivati che hanno minore sensibilità agli acidi e presentano maggiore 
assorbimento nel tratto gastrointestinale, maggiore resistenza alla distruzione da parte della penicillinasi come 
meticillina e oxacillina, o un più ampio spettro di attività nei confronti dei batteri gram-negativi come 
ampicillina, carbenicillina, ticarcillina, piperacillina. Nelle cefalosporine l’anello β-lattamico è fuso con un 
anello diidrotiazinico, mentre le cefamicine contengono ossigeno al posto dello zolfo nell’anello diidrotiazinico. 
Presentano entrambe lo stesso meccanismo d’azione delle penicilline, ma un più ampio spettro antibatterico, 
resistenza a molte β-lattamasi e migliori proprietà farmacocinetiche. Sfortunatamente i batteri gram-negativi 
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hanno sviluppato rapidamente una resistenza a cefalosporine e cefamicine, che ha compromesso l’uso di questi 
farmaci. I carbapenemi sono antibiotici ad ampio spettro, mentre i monobattamici sono a spettro ristretto (attivi 
solo contro batteri gram-negativi aerobi); tuttavia, nonostante il vantaggio di non distruggere la normale flora 
batterica intestinale del paziente, questi ultimi sono scarsamente utilizzati. 
Nel gruppo dei polipeptidi troviamo la bacitracina e le polimixine. La bacitracina, isolata da Bacillus 
licheniformis, è una miscela di polipeptidi utilizzata in prodotti per uso topico (creme, unguenti, spray) per il 
trattamento di infezioni della pelle causate da batteri gram-positivi, mentre i batteri gram-negativi presentano 
resistenza. Essa inibisce la sintesi della parete cellulare interferendo con la defosforilazione e il riciclaggio del 
lipide trasportatore responsabile del passaggio dei precursori del peptidoglicano dalla membrana citoplasmatica 
batterica alla parete cellulare. Può anche danneggiare la membrana citoplasmatica ed inibire la trascrizione 
dell’RNA. Le polimixine sono un gruppo di polipeptidi ciclici derivati da Bacillus polymyxa. Si inseriscono nelle 
membrane batteriche ed interagiscono con i lipopolisaccaridi e con i fosfolipidi della membrana esterna, 
causando un aumento di permeabilità cellulare. Possono causare gravi problemi di nefrotossicità e sono 
impiegate nel trattamento di infezioni localizzate, in particolare quelle provocate da bacilli gram-negativi, poiché 
i batteri gram-positivi non presentano una membrana esterna e quindi non sono sensibili a questi antibiotici. 
Vi è poi un gruppo di antibiotici attivi sulla parete cellulare utilizzati per il trattamento di infezioni da 
micobatteri, comprendente isoniazide, etionamide, etambutolo e cicloserina. L’isoniazide (idrazide dell’acido 
isonicotinico [INH]) è battericida sui micobatteri che si replicano attivamente, andando ad influenzare la sintesi 
dell’acido micolico. Anche l’etionamide, un derivato di INH, blocca la sintesi degli acidi micolici. L’etambutolo 
interferisce con la sintesi dell’arabinogalattano presente nella parete, mentre la cicloserina inibisce due enzimi, la 
D-alanina D-alanina sintetasi e l’alanina racemasi, che intervengono nella sintesi della parete. 
La classe di antibiotici inibitori della sintesi della parete cellulare comprende anche il gruppo dei glicopeptidi, 
antibiotici battericidi che inibiscono la formazione della parete batterica, interferendo con la polimerizzazione 
del peptidoglicano. Questi antibiotici vengono utilizzati nelle gravi infezioni da batteri resistenti ai β-lattamici, 
contro cocchi e bacilli gram-positivi, in quanto i gram-negativi sono naturalmente resistenti. A questo gruppo 
appartengono gli antibiotici vancomicina e teicoplanina, molecole di elevato peso molecolare, che non riescono 
quindi ad attraversare la membrana cellulare esterna dei gram-negativi. In particolare, per la vancomicina, 
oggetto di studio del mio lavoro di tesi, descriverò le principali caratteristiche e proprietà in modo più 
approfondito in un paragrafo successivo. 
2.1.b Inibitori della sintesi proteica. 
La principale azione di questi farmaci, che appartengono alla seconda più vasta classe di antibiotici, è 
l’inibizione della sintesi proteica. 
Fanno parte di questa classe amminoglicosidi, tetracicline, cloramfenicolo, macrolidi, clindamicina, 
streptogramine ed oxazolidinoni. Gli antibiotici amminoglicosidici sono composti da amminozuccheri legati da 
legami glicosidici ad un anello di amminociclitolo. Riescono a penetrare la membrana esterna dei gram-negativi, 
la parete cellulare e la membrana cellulare, e nel citoplasma inibiscono la sintesi batterica, legandosi 
irreversibilmente alle proteine della subunità 30S dei ribosomi ed esplicando così un’azione battericida. Sono 
utilizzati per trattare infezioni gravi provocate da batteri gram-negativi e da alcuni gram-positivi. Gli 
streptococchi e gli enterococchi sono resistenti agli amminoglicosidi perché tali antibiotici non riescono ad 
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attraversare la parete cellulare di questi batteri. I composti più comunemente utilizzati sono l’amikacina, la 
gentamicina e la tobramicina, impiegati tutti e tre nel trattamento delle infezioni sistemiche da batteri gram-
negativi sensibili. L’amikacina è impiegata per trattare infezioni da gram-negativi resistenti alla gentamicina e 
alla tobramicina. 
Le tetracicline sono antibiotici batteriostatici ad ampio spettro che inibiscono la sintesi proteica nei batteri, 
bloccando il legame dell’amminoacil-RNA transfer (tRNA) al complesso subunità ribosomiale 30S-mRNA. 
Tetraciclina, doxicillina e minociclina sono efficaci nel trattamento di infezioni provocate da Mycoplasma, 
Rickettsia e altri batteri gram-positivi e gram-negativi. Tutte hanno uno spettro di attività simile, mentre 
doxiciclina e minocillina hanno diverse proprietà farmacocinetiche, in quanto vengono più facilmente assorbite e 
mostrano una più lunga emivita. 
Il cloramfenicolo possiede ampio spettro antibatterico, ma è poco utilizzato perché, oltre ad inibire la sintesi 
proteica batterica, interferisce con la sintesi proteica delle cellule umane del midollo osseo. Esercita il proprio 
effetto batteriostatico legandosi alla componente peptidiltransferasica della subunità ribosomiale 50S, bloccando 
così l’allungamento del peptide. 
Il composto di riferimento dei macrolidi è l’eritromicina, prodotta dallo Streptomyces erythreus. La struttura 
base di questa classe di antibiotici è un lattone macrociclico legato a due zuccheri, desosammina e cladinosio. 
Agiscono legandosi reversibilmente all’RNA 23S della subunità ribosomiale 50S, bloccando l’allungamento del 
polipeptide. Sono antibiotici ad ampio spettro di attività, utilizzati nel trattamento di infezioni polmonari 
provocate da Mycoplasma, Legionella e Clamydia, e da batteri gram-positivi in pazienti allergici alla penicillina. 
La maggior parte dei batteri gram-negativi è resistente ai macrolidi. 
La clindamicina fu isolata dallo Streptomyces lincolnensis. Come il cloramfenicolo e i macrolidi, blocca 
l’allungamento della catena proteica legando la subunità ribosomiale 50S. Inibisce la peptidiltransferasi 
interferendo con il legame del complesso amminoacido-acil-tRNA. E’ attiva sugli stafilococchi e sui bacilli 
gram-negativi anaerobi, ma è generalmente inattiva sui batteri gram-negativi aerobi. 
Le streptogramine sono una classe di peptidi ciclici prodotti da specie del genere Streptomyces. Attualmente è 
disponibile in terapia il quinupristin-dalfopristin (nome commerciale Synercid) costituito dalla combinazione dei 
due antibiotici quinupristina e dalfopristina. La dalfopristina si lega alla subunità ribosomiale 50S ed induce un 
cambiamento conformazionale che facilita il legame della quinupristina. La dalfopristina previene 
l’allungamento della catena peptidica e la quinupristina favorisce il rilascio prematuro delle catene 
polipeptidiche dal ribosoma. L’associazione dei farmaci è attiva contro stafilococchi, streptococchi ed E. 
faecium. 
Infine a questa classe di antibiotici appartengono gli oxazolidinoni, tra cui il linezolid, oggetto della mia tesi, di 
cui descriverò le caratteristiche principali e le proprietà in un paragrafo successivo. 
2.1.c Inibitori della sintesi degli acidi nucleici. 
I principali composti di questa classe sono i chinoloni, rifampicina, rifabutina e metronidazolo. 
I chinoloni sono agenti chemioterapici di sintesi che inibiscono la DNA topoisomerasi batterica di tipo II (girasi) 
o la DNA topoisomerasi batterica di tipo IV, enzimi indispensabili per la replicazione, la ricombinazione e la 
riparazione del DNA. Nei batteri gram-negativi, la subunità A della girasi rappresenta il principale bersaglio dei 
chinoloni, mentre la topoisomerasi di tipo IV è il principale bersaglio nei batteri gram-positivi. L’acido 
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nalidixico è stato il primo chinolone impiegato in terapia, ora sostituito da composti più attivi, come la 
ciprofloxacina, levofloxacina, gatifloxacina e moxifloxacina (fluorochinoloni), con eccellente attività sia sui 
gram-positivi che sui gram-negativi. 
La rifampicina, un derivato semisintetico della rifamicina B, prodotta dallo Streptomyces mediterranei, si lega 
all’RNA polimerasi DNA-dipendente ed inibisce la sintesi dell’RNA. E’ battericida per Mycobacterium 
tubercolosis ed è particolarmente attiva sui cocchi gram-positivi aerobi, inclusi gli stafilococchi e gli 
streptococchi, mentre i batteri gram-negativi sono intrinsecamente resistenti alla rifampicina. 
La rifabutina, derivata anche questa dalla rifamicina, possiede un meccanismo d’azione simile alla rifampicina 
ed un analogo spettro di attività. 
Il metronidazolo è un farmaco che venne introdotto in origine per il trattamento per via orale delle vaginiti 
causate dal protozoo Trichomonas, ma è efficace anche nel trattamento di amebiasi, giardiasi e di gravi infezioni 
da batteri aerobi. Le sue proprietà antibatteriche derivano dalla riduzione del suo nitrogruppo da parte di 
nitroriduttasi batteriche, che producono composti citotossici in grado di distruggere il DNA batterico. 
2.1.d Antimetaboliti. 
I sulfamidici sono antimetaboliti che competono con l’acido p-amminobenzoico, impedendo la sintesi dell’acido 
folico, elemento fondamentale per la crescita di molti microorganismi. Poiché i mammiferi non sintetizzano 
l’acido folico, i sulfamidici non interferiscono con il metabolismo delle cellule umane. Sono efficaci contro un 
gran numero di batteri gram-positivi e gram-negativi, come Nocardia e Chlamydia e anche contro alcuni 
protozoi. 
Il trimethoprim interferisce con il metabolismo dell’acido folico inibendo la diidrofolato reduttasi e impedendo 
la conversione di diidrofolato a tetraidrofolato. Blocca la formazione di timidina, di alcune purine, di metionina e 
di glicina. L’associazione trimethoprim-sulfametossazolo è efficace contro un gran numero di gram-positivi e di 
gram-negativi ed è il farmaco di elezione per il trattamento di infezioni del tratto urinario sia acute che croniche. 
Agisce anche contro infezioni del tratto respiratorio inferiore, otite media e gonorrea. 
Vi sono infine il dapsone e l’acido p-amminosalicilico, antifolati utili nel trattamento di infezioni da micobatteri. 
2.2 Linezolid. 
Il linezolid (figura 2.1) è il primo composto di una nuova classe di farmaci antibatterici, gli oxazolidinoni, ad 
essere entrato in terapia intorno al 2000. Scoperti alla fine degli anni ’80, fu in seguito abbandonata la ricerca su 
di essi, per essere poi ripresa agli inizi degli anni ’90, con la sintesi di analoghi non tossici e con buona attività 
antibatterica. 
Figura 2.1. Struttura molecolare del linezolid (pK= 1,8) 
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Gli oxazolidinoni legano la subunità 50S del ribosoma batterico, prevenendo la formazione del complesso con la 
subunità 30S, l’mRNA, i fattori di trascrizione e il formilmetionil-tRNA. Il risultato è il blocco della formazione 
del complesso di inizio della trascrizione per la sintesi proteica (Livermore, 2003). Questo meccanismo d’azione 
è un po’ diverso da quello di altri composti inibitori della sintesi proteica come il cloramfenicolo, i macrolidi, le 
tetracicline, che agiscono impedendo l’allungamento del peptide in formazione: per questo motivo difficilmente 
si verifica resistenza crociata (figura 2.2). 
Figura 2.2. Meccanismo d’azione degli oxazolidinoni. Gli oxazolidinoni si combinano con la subunità ribosomiale 50S, prevenendo la 
formazione del complesso con la subunità 30S, l’mRNA, i fattori di trascrizione ed il formilmetionil-tRNA. Di conseguenza non si ha 
formazione di alcun complesso di inizio della trascrizione e la sintesi proteica è bloccata. Altri composti inibitori della sintesi proteica 
bloccano invece l’allungamento del peptide (da Livermore, 2003). 
Il linezolid presenta attività batteriostatica, e in virtù del suo diverso meccanismo d’azione, è attivo verso 
numerose specie di batteri gram-positivi, come streptococchi, stafilococchi ed enterococchi, che presentano 
resistenza nei confronti di altre terapie antibiotiche. Di notevole importanza è l’attività verso infezioni provocate 
da ceppi di Staphylococcus aureus meticillina-resistenti (MRSA) e da enterococchi vancomicina-resistenti 
(VRE), quale Enterococcus faecium, infezioni della pelle e dei tessuti molli, i cui principali agenti eziologici 
sono Staphylococcus aureus e Streptococcus pyogenes, polmoniti associate a batteriemie causate da 
Streptococcus pneumoniae sensibile alla penicillina, polmoniti nosocomiali, polmoniti acquisite in seguito a vita 
in comunità. E’ inoltre attivo verso Mycobacterium tubercolosis ed altre specie di micobatteri. 
La somministrazione di una dose da 600 mg ogni 12 ore permette di raggiungere e mantenere la concentrazione 
minima inibitoria (MIC) per l’intera durata dell’intervallo terapeutico. Lo “steady-state” viene raggiunto dopo 
due-quattro dosi, con una concentrazione plasmatica minima (C) intorno a 4 mg/L e una concentrazione 
min
plasmatica massima (C) di 13-15 mg/L (Jungbluth et al., 2003), rimanendo quindi sempre al di sopra della 
max
MIC per i batteri sensibili al linezolid, compresa tra 0,5 e 4 mg/L (Livermore, 2003). 
Il linezolid viene rapidamente e completamente assorbito dopo somministrazione per via orale, raggiungendo la 
C dopo 1-2 ore dalla somministrazione. Presenta biodisponibilità intorno al 100%, il che permette il passaggio 
max
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