Inibitori di tirosinchinasi a struttura chinazolinica: sintesi di derivati 4-amminoarilici

2. INTRODUZIONE 
Attualmente la maggior parte delle strategie utilizzate nella cura delle patologie 
tumorali utilizza farmaci non selettivi nei confronti delle cellule cancerose, 
portando sia alla regressione della massa tumorale che alla distruzione dei 
1
tessuti sani, con forti ricadute fisiche sul paziente. 
Fra i target più interessanti per lo sviluppo di farmaci antitumorali possono essere 
incluse le chinasi, un’ampia famiglia di proteine di membrana coinvolte in diversi 
processi di trasduzione del segnale intracellulare. Caratteristica generale di 
questi enzimi è quella di essere in grado di trasferire una funzione fosfato da ATP 
o GTP a specifici residui amminoacidici (serina, treonina, tirosina) appartenenti a 
substrati proteici diversi. A seconda dell’amminoacido fosforilato le proteinchinasi 
2
vengono classificate in serin-treoninchinasi o tirosinchinasi. 
Quando una proteinchinasi viene attivata e fosforilata, essa promuove a sua 
volta la fosforilazione, e conseguente attivazione, di una seconda chinasi, dando 
il via ad un processo a cascata che porta all’amplificazione del segnale. 
Risulta evidente come la deregolazione o la sovraespressione di questi enzimi 
possano compromettere severamente le normali funzionalità cellulari. 
Infatti, alterazioni che coinvolgano chinasi implicate nel processo di replicazione 
possono essere alla base di patologie iperproliferative, come il cancro. 
Per tale motivo le chinasi rappresentano uno dei target più interessanti per la 
progettazione e lo sviluppo di farmaci antitumorali, che possiedano selettività nei 
confronti dei tessuti malati rispetto a quelli sani. 
Fra le diverse classi di proteinchinasi, negli ultimi anni particolare attenzione è 
stata posta nei confronti delle tirosinchinasi. 
3 
Introduzione 
3
2.1. LE TIROSINCHINASI DI MEMBRANA 
Le tirosinchinasi (Tyrosine Kinases, TK) sono delle proteine ad attività chinasica 
con la peculiare capacità di fosforilare residui tirosinici nelle catene proteiche di 
specifici substrati. Tali enzimi possono a loro volta essere suddivisi in due classi, 
le TK citoplasmatiche (fra cui ricordiamo src, lck e abl) e le TK di membrana (o 
Recettoriali, Receptor Tyrosine Kinases RTK, fra cui ricordiamo EGFR, VEGFR-2 
e PDGFR). 
I recettori tirosinchinasici possiedono un dominio extracellulare, dove è presente 
il sito di legame per il ligando, un dominio transmembrana e un dominio 
intracellulare ad attività chinasica, che si può dividere in due porzioni: un dominio 
catalitico, con i siti di legame per l’ATP e per il substrato, e una porzione 
carbossi-terminale, dove sono presenti i residui tirosinici per l’autofosforilazione 
(Figura 3). 
Dominio per glicosilazione
Dominio di riconoscimento 
per il Fattore di Crescita
Dominio catalitico per il 
legame con l’ATP e per la 
tirosin fosforilazione
Dominio transmembrana
Tyr
Tyr
Tyr
COOH
 Figura 3. Rappresentazione schematica di una RTK. 
4 
Introduzione 
I ligandi naturali per le RTK vengono anche definiti fattori di crescita, in quanto, a 
seguito del loro legame con il dominio recettoriale extracellulare, viene attivata 
una cascata di segnali che porta alla proliferazione cellulare. In particolare, la loro 
azione si esplica consentendo il passaggio della cellula dalla fase G0 
(quiescienza) alla fase G1 del ciclo cellulare. 
Una volta attivata, la RTK va incontro alla formazione di un dimero capace di 
autofosforilare i propri residui tirosinici, presenti nella porzione carbossi-
4
terminale, diventando così in grado di fosforilare un’ulteriore chinasi (Figura 4). 
Figura 4. Meccanismo di attivazione di una RTK. 
La maggior parte delle RTK è codificata da proto-oncogeni: mutazioni genetiche 
in grado di portare alla sovraespressione di questi recettori o alla produzione di 
forme costitutivamente attive sembrano essere una delle principali cause 
dell’insorgenza di malattie tumorali. 
Poichè studi recenti hanno messo in luce come le RTK siano fondamentali sia 
per lo sviluppo fetale e adolescenziale che per il cancro, ma perdano di 
importanza nell’organismo adulto sano, la loro inibizione mirata può costituire una 
valida strategia antitumorale a basso impatto in termini di tossicità per i tessuti 
5
sani. 
5 
Introduzione 
6,7
2.1.1. RECETTORE DEL FATTORE DI CRESCITA EPIDERMICO 
Il recettore del fattore di crescita epidermico (EGFR, Epidermal Growth Factor 
Receptor) è una RTK di 170 KDa appartenente alla famiglia ErbB/Her, costituita 
da 4 membri: Her-1 (EGFR appunto), Her-2, Her-3 ed Her-4. Questi recettori 
rappresentano il centro di una complessa cascata di segnali intracellulari che 
modula la proliferazione, l’adesione, la migrazione e la differenziazione cellulare. 
Il dominio extracellulare è poco conservato fra i diversi membri della famiglia e 
questo spiega perché i recettori presentino una diversa affinità per i ligandi 
appartenenti alla classe dei fattori di crescita epidermici (EGF). 
Il processo di dimerizzazione recettoriale a seguito dell’attivazione può portare 
sia alla formazione di omodimeri (costituiti dall’unione di due recettori uguali tra 
loro) che di eterodimeri (costituiti dall’unione di due recettori diversi). Tale 
processo è in grado di aumentare l’efficienza della trasmissione del segnale, ma 
ha conseguenze drammatiche nella terapia antitumorale basata sull’inibizione di 
EGFR. Questa RTK, infatti, risulta sovraespressa nella maggior parte dei tumori 
solidi, e in particolare nel tumore al polmone non a piccole cellule (Non Small 
Cells Lung Cancer, NSCLC) e nel tumore mammario, dove l’espressione del 
recettore passa da 40.000-100.000 unità per cellula (nei tessuti sani) a 2.000.000 
di unità per cellula. 
6 
Introduzione 
2.1.2. RECETTORE DEL FATTORE DI CRESCITA DELL’ENDOTELIO 
8
VASCOLARE 
In alcuni tumori solidi umani è spesso evidenziabile una sovraespressione di 
un’altra famiglia di recettori tirosinchinasici: i recettori del fattore di crescita 
dell’endotelio vascolare (VEGFR, Vascular Endothelial Growth Factor Receptor). 
Questi recettori, una volta attivati, danno inizio ad una serie di fenomeni 
intracellulari, che portano alla proliferazione delle cellule endoteliali. 
I VEGFR sono di tre tipi (VEGFR-1, VEGFR-2 e VEGFR-3) e sono i principali 
regolatori del fenomeno dell’angiogenesi, processo che porta alla formazione di 
nuovi vasi sanguigni a partire da quelli già esistenti. Tale fenomeno gioca un 
ruolo importante sia dal punto di vista fisiologico (formazione della placenta, 
ovulazione e rigenerazione dei tessuti), sia dal punto di vista patologico, poiché 
l’iperproliferazione vasale è alla base di numerose malattie, come la psoriasi, la 
retinopatia diabetica, l’artrite reumatoide e il cancro: una ricca vascolarizzazione 
infatti aiuta la crescita della massa tumorale ed è una delle cause del fenomeno 
della metastasi. La principale RTK coinvolta nel cancro è VEGFR-2 (o KDR, 
Kinase Domain Receptor), ma studi attuali hanno messo in luce come anche 
VEGFR-1 possa essere coinvolto nella patogenesi tumorale, anzichè essere 
9
solamente un decoy-receptor per VEGF, come inizialmente supposto. 
Appare quindi evidente l’importanza dello sviluppo di farmaci con attività anti-
angiogenica: questi, infatti, inibiscono la crescita dei vasi raggiungendo senza 
difficoltà l’endotelio, bloccando la crescita del tumore e il processo di metastasi. 
In letteratura sono riportate diverse strutture di farmaci inibitori di VEGFR-2 e 
alcuni di questi presentano lo stesso scaffold chinazolinico degli inibitori di EGFR. 
Le vie metaboliche regolate dai due recettori sono tra di loro interconnesse: 
recenti studi hanno dimostrato che l’inibizione di VEGFR-2 è in grado di 
aumentare la sensibilità del tumore agli inibitori di EGFR e che l’inibizione 
dell’azione mediata da EGF porta alla riduzione della secrezione di VEGF (il 
ligando naturale per i VEGFR). 
L’associazione farmacologica di inibitori dei due recettori è un argomento di 
grande attualità, in quanto questo tipo di terapia consente di colpire il tumore su 
diversi fronti: 
7 
Introduzione 
 l’inibizione di EGFR porta all’arresto della crescita della massa tumorale 
(inibizione diretta della progressione cancerosa); 
 l’inibizione di VEGFR-2 porta al blocco della vascolarizzazione tumorale, 
impedendo così l’arrivo di nutrienti alla massa neoplastica (inibizione 
indiretta della progressione cancerosa); 
 l’arresto dell’angiogenesi porta ad una minor probabilità di metastasi, 
essendo i vasi sanguigni tumorali il primo veicolo per la disseminazione 
delle cellule metastatiche nell’organismo. 
La possibilità di avere degli inibitori duali permetterebbe di evitare di dover 
ricorrere ad associazioni di più farmaci. 
2.2. STRATEGIE PER L’INIBIZIONE DI EGFR E VEGFR-2 
La ricerca nel campo dell’inibizione delle RTK ha portato all’individuazione di tre 
10
possibili strategie terapeutiche (Figura 5), costituite dall’uso di: 
1. anticorpi monoclonali, impiegati come singoli farmaci o come vettori di 
radionuclidi, tossine, o profarmaci; agiscono legandosi al dominio 
extracellulare delle RTK, impedendo l’interazione con il fattore di crescita; 
2. piccole molecole organiche, che fungono da inibitori competitivi ATP-
mimetici; 
3. oligonucleotidi antisenso e ribozimi, che agiscono bloccando i meccanismi 
deputati alla produzione delle RTK. 
Attualmente, le strategie terapeutiche sono basate solo su farmaci appartenenti 
alle prime due classi sopracitate. 
8 
Introduzione 
Figura 5. Schematizzazione delle strategie di inibizione di RTK. 
1 = anticorpi monoclonali; 
2 = inibitori ATP-mimetici; 
3 = oligonucleotidi antisenso. 
Tuttavia, le cellule possono sviluppare diverse strategie per acquisire resistenza 
alla terapia adottata (Figura 6) e attualmente, per ovviare a questo problema, ci si 
basa su terapie multi-farmaco. 
Figura 6. Meccanismi di resistenza all’inibizione delle RTK. 
1 = resistenza agli anticorpi monoclonali; 
2 = resistenza agli inibitori competitivi ATP-mimetici; 
3 = resistenza agli oligonucleotidi antisenso. 
9 
Introduzione 
Quindi, in funzione del tipo di strategia di inibizione adottata, la cellula può 
diventare resistente secondo uno o più dei seguenti meccanismi: 
1. modifica del recettore che diventa costitutivamente attivo e in grado di 
dimerizzare senza intervento del fattore di crescita; 
2. modifica strutturale della tasca di interazione con l’ATP che diventa meno 
sensibile all’azione degli inibitori ATP-mimetici; 
3. mutazioni genetiche e variazione dell’mRNA per la codifica delle TK. 
In ogni caso, fra le diverse strategie inibitorie, la più promettente risulta 
attualmente quella basata sugli inibitori competitivi dell’ATP (TKI), sia per la 
maggior facilità di somministrare piccole molecole organiche rispetto a strutture 
proteiche o nucleiche, sia per la possibilità di individuare TKI multitarget, cioè in 
grado di inibire contemporaneamente e in maniera efficace più RTK. Va inoltre 
considerato che i TKI mantengono la loro attività inibitoria anche in presenza di 
mutazioni alle RTK che le rendano costitutivamente attive. 
I TKI possono presentare scaffold estremamente diversi e a seconda della classe 
di composti che si utilizza ci si può indirizzare verso l’inibizione dell’una o l’altra 
RTK. Di particolare interesse sono risultati i derivati 4-anilinochinazolinici, in 
grado di inibire EGFR o VEGFR-2 (a seconda della decorazione dello scaffold) 
già a concentrazioni nanomolari. 
Fra gli inibitori selettivi di EGFR a struttura chinazolinica vanno menzionati 
11
Erlotinib (approvato nel novembre del 2004 dall’FDA per la cura del NSCLC, 
1213
primo inibitore selettivo di EGFR a entrare in terapia), Gefitinib e PD153035 
(Figura 7). 
10 
Introduzione 
Figura 7. Strutture di inibitori 4-anilinochinazolinici selettivi per EGFR. 
L’analisi cristallografica del complesso EGFR-Erlotinib (Figura 8) ha permesso di 
individuare i punti di interazione fra inibitore e recettore, evidenziando che l’azoto 
769
in posizione 1 interagisce con il gruppo ammidico della Met, l’azoto in 3 
766
interagisce con la Thr attraverso un ponte idrogeno mediato da una molecola 
di acqua, le catene alcossiliche in posizione 6 e 7 si trovano esposte al solvente 
e, infine, la porzione acetilenica si inserisce in una tasca idrofobica non presente 
14
in altre chinasi (come ad esempio le CDK), conferendo selettività verso EGFR. 
Figura 8. Punti di interazione fra Erlotinib ed EGFR. 
11 
Introduzione 
In letteratura, accanto alle osservazioni spettroscopiche, compaiono anche 
numerosi studi virtuali per la progettazione e lo studio in silico di derivati 4-
anilinochinazolinici come inibitori selettivi di EGFR. 
In particolare, uno studio 3D-QSAR, eseguito su una vasta libreria di derivati (174 
molecole), si è occupato di identificare i requisiti sterici, idrofobici e idrofilici dei 
15
sostituenti con cui funzionalizzare adeguatamente lo scaffold chinazolinico 
(Figura 9). 
Gruppi in grado di formare 
Gruppi ingombranti e 
ponti idrogeno 
idrofobici 
Gruppi alchilici o 
poveri di elettroni 
HN
R
3
R
1
N
RN
2
 Figura 9. Schematizzazione dei risultati dello studio 3D-QSAR. 
Dallo studio emerge che: 
 l’azoto anilinico non deve avere sostituenti: anche la presenza di un metile 
porta ad una significativa riduzione di attività; 
 R e R devono contenere atomi elettronegativi legati a catene 
12
idrofobiche, formando ad esempio derivati amminici o alcossilici; 
 R deve essere un gruppo idrofobico, preferibilmente in posizione meta 
3
rispetto all’azoto anilinico. All’interno della serie degli alogeni l’ordine di 
potenza è: Br > Cl > I > F. 
 Un gruppo ingombrante vicino a R, R o R potrebbe diminuire la potenza 
123
inibitoria. 
Di più recente scoperta rispetto ad Erlotinib è, invece, un derivato 4-
anilinochinazolinico (Vandetanib, Figura 10) in grado di inibire in maniera 
efficiente sia EGFR che VEGFR-2: attualmente Vandetanib è l’unico TKI 
duale a struttura anilinochinazolinica in fase di sperimentazione clinica. 
12