Studio della variabilità genetica in Pyrenophora graminea e P. teres mediante tecniche di PCR e RFLP dello spaziatore intergenico del DNA ribosomale

 5 
I. INTRODUZIONE 
 
 
 
1.1. Pyrenophora graminea e P. teres 
La coltura dell’orzo è andata estendendosi sempre più nel corso degli ultimi trent’anni 
estendendosi nelle aree agricole più settentrionali del nostro paese. Proprio la sua espansione 
verso ambienti più freddi ed umidi ha favorito la diffusione di alcune delle malattie più 
importanti per questo cereale: la striatura bruna e la reticolatura bruna. La striatura bruna è 
favorita dall’elevata suscettibilità al patogeno delle varietà più produttive e dall’assenza sul 
mercato di prodotti in grado di controllarla, dopo l’abolizione dei composti mercurio-organici. 
Anche se non esistono stime attendibili circa l’incidenza di questa malattia sulla perdita del 
prodotto si ritiene che il danno possa raggiungere punte del 50% o valori anche superiori tali, 
comunque, da rendere la coltura non più economica (Vannacci et al., 1993). La reticolatura 
bruna, invece, è dannosa da sola o se associata ad altri patogeni (Shipton et al., 1973). Nei 
paesi europei, con l’eccezione della Norvegia, fino agli inizi degli anni settanta, non ha destato 
grande preoccupazione per le perdite produttive come invece accadeva in molti paesi 
dell’America sia del Nord che del Sud, in Africa, in Australia e nel medio oriente (Shipton et 
al., 1973). 
 
Pyrenophora graminea (Ito & Kuribayaschi), [anamorfo Drechslera graminea (Rabenh. ex 
Schlecht.) Shoemaker] (sin. Helminthosporium gramineum Rabenh. ex Schlecht), e P. teres 
Drechs. [anamorfo D. teres (Sacc.) Shoemaker] sono, rispettivamente, gli agenti patogeni 
della striatura bruna e della reticolatura bruna dell’orzo.  
 P. graminea è un patogeno trasmesso unicamente per seme, non essendo in grado di 
causare infezioni secondarie, e può essere presente come micelio nelle glume, nel pericarpo o 
nei tegumenti seminali della cariosside. Quando il seme germina, il micelio si accresce 
penetrando nella plantula attraverso la coleoriza. L’invasione di quest’ultima avviene 
intercellularmente (Skoropad e Arny, 1956). Dalla coleoriza il micelio passa al coleoptile ed il 
fungo può colonizzare la pianta sistemicamente durante la crescita. Nelle foglie l’avanzamento 
del micelio avviene nel tessuto spugnoso parallelamente alle nervature oppure entro i vasi 
xilematici. Sulle foglie si formano dapprima delle striature clorotiche che decorrono 
 6 
parallelamente alle nervature. Successivamente tali striature imbruniscono, il tessuto 
necrotizza e le foglie si sfettucciano (sfrangiatura fogliare) (Smedegård-Petersen, 1983).  
P. teres può essere trasmesso per seme ma la sua diffusione avviene principalmente 
attraverso residui di piante infette (Smedegård-Petersen, 1976). La striatura bruna è una 
malattia ad interesse composto, essendo il patogeno in grado di causare infezioni secondarie. 
Del patogeno si conoscono due forme che si differenziano per il tipo di sintomi (Smedegård-
Petersen, 1971). P. teres f. teres causa lesioni reticolate; sulle foglie, inizialmente, si formano 
piccole macchie e strie che si espandono rapidamente sia longitudinalmente che 
trasversalmente dando alle lesioni il tipico aspetto reticolato. I tessuti infetti della foglia 
necrotizzano e quelli adiacenti diventano clorotici (Smedegård-Petersen, 1983). La seconda 
forma è quella di P. teres f. maculata che causa lesioni marrone scuro di forma ellittica o 
fusiformi circondate da una zona clorotica. La clorosi si può poi estendere su tutta la pagina 
fogliare. Successivamente la foglia avvizzisce (Smedegård-Petersen, 1983). I sintomi delle 
malattie sono raffigurati in Fig. 1. 
 Anche se P. teres e P. graminea producono sintomi diversi su orzo ed appartengono a  
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 7 
specie diverse è stato dimostrato che questi due funghi sono in grado di incrociarsi dando 
progenie fertile. Questa particolare proprietà indica che le due specie sono strettamente 
correlate, infatti P. teres e P. graminea hanno caratteristiche morfologiche e biologiche molto 
simili (Smedegård-Petersen, 1983). 
La stretta somiglianza tra le due specie spesso pone i patologi di fronte a non poche 
difficoltà nel loro riconoscimento. Su pianta le malattie sono facilmente distinguibili tramite 
l’esame dei sintomi sulle foglie ma se si vuole verificare la presenza dell’uno o dell’altro 
patogeno su seme le analisi diventano lunghe ed anche difficoltose in quanto, sebbene 
l’identificazione del genere Pyrenophora allo stereomicroscopio, con un minimo di esperienza, 
non sia particolarmente arduo si incontrano notevoli difficoltà nel distinguere P. graminea da 
P. teres (Vannacci, 1984; Reeves e Ball, 1991). 
Queste difficoltà, connesse con la necessità di distinguere i due patogeni a causa delle 
diverse caratteristiche epidemiologiche, ha spinto la ricerca verso la messa a punto di nuovi 
metodi di diagnosi più veloci e più sicuri  
 
 
1.2. Lo spaziatore intergenico del DNA ribosomale (IGS).  
I ribosomi sono gli organelli responsabili della sintesi proteica ovvero della traduzione del 
codice genetico. Questi sono costituiti per il 65% da RNA ribosomale (rRNA) e per il 35% da 
proteine. L’RNA ribosomale è codificato da quella porzione di DNA chiamata DNA ribosomale 
(rDNA).  
Esistono diversi tipi di ribosomi, questi si differenziano per la loro grandezza che viene 
misurata tramite il coefficiente di sedimentazione Svedberg (S). Questa unità di misura indica 
la velocità con la quale i ribosomi sedimentano dopo centrifugazione. Si possono così 
distinguere ribosomi 70S e 80S. I primi sono costituiti da due subunità: una, con coefficiente 
di sedimentazione 30S (large subunit); e l’altra con coefficiente di sedimentazione 50S (small 
subunit). I ribosomi 70S sono tipici degli organismi procariotici e dei mitocondri e cloroplasti, 
degli organismi eucariotici. I ribosomi 80S sono costituiti dalle subunità 40S e 60S e si trovano 
nel citoplasma degli eucarioti; i funghi hanno quindi ribosomi 80S. La subunità 60S è 
composta da rRNA di tipo 5S, 5,8S, 16-18S e 23-28S e da più di 50 proteine. 
I geni che codificano per gli rRNA 16-18S, 5,8S e 23-28S sono organizzati in sequenze 
ripetute in tandem. Ogni unità ripetuta consiste in una regione trascritta separata, dalla 
successiva unità, da una regione chiamata spaziatore intergenico (IGS). Alcuni hanno 
 8 
chiamato questa regione spaziatore esterno non trascritto, NTS (Specht et at., 1984; Buckner 
et al., 1988; Garber et al., 1988). Altri hanno definito l’NTS come la parte non trascritta 
dell’IGS per separarla dalla regione che in realtà viene trascritta (ETS, dall’inglese “external 
transcribed spacer”) e che si trova adiacente all’estremità 3’ e 5’ dei geni 25S e 18S (King et 
al., 1993). Altri ancora l’hanno denominata semplicemente regione intergenica, IGR (Buchko 
e Klassen, 1990; Morton et al., 1995). 
Negli eucarioti la regione trascritta contiene le tre regioni geniche (18S, 5,8S e 28S) 
separate da due regioni interne trascritte (ITS, dall’inglese “internal transcribed spacer”). 
L’organizzazione di un’unità di rDNA è mostrata in Fig. 2. 
I geni per l’rRNA 5S di solito non sono associati ai geni per gli RNA 18S, 5,8S e 28S; le sole  
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
eccezioni note a questa regola generale sono rappresentate da alcuni funghi e protozoi 
(Singer e Berg, 1997). 
 
 
 9 
All’interno della stessa specie l’rDNA può mostrare differenze nel numero delle unità 
ripetute e nella lunghezza dell’IGS con variazioni anche tra gli individui. Negli eucarioti l’IGS 
può contenere degli elementi ripetuti e la variabilità in lunghezza è probabilmente dovuta a 
crossing-over ineguali tra questi, durante i processi meiotici. 
Tale asserzione è dimostrata dal polimorfismo dei frammenti ottenuti con endonucleasi di 
restrizione (RFLP) ed ancor più dal confronto delle sequenze nucleotidiche degli spaziatori 
stessi; per questo motivo l’IGS è sempre più frequentemente usato negli studi di variabilità 
genetica all’interno di popolazioni.  
Ad esempio, isolati di diverse specie di Metarhizium spp. (un fungo patogeno di insetti 
fitofagi) sono state differenziate, tramite RFLPs, delle regioni ITS ed IGS (Pipe et al., 1995). 
Nella ectomicorriza Hebeloma cylindrosporum l’IGS è stato impiegato per studiare la diversità 
intraspecifica (Guidot et al., 1999) ed in popolazioni di Fusarium oxysporum variazioni 
intraspecifiche sono state identificate tramite tecniche di PCR/RFLP ed ERIC dell’ITS e dell’IGS 
(Edel et al., 1995). 
La struttura dell’IGS risulta essere piuttosto complessa poiché sembra che al suo interno 
esistano delle regioni che controllano e regolano la trascrizione dell’rDNA Gli studi effettuati a 
questo riguardo sulla regione IGS di funghi, piante, animali hanno evidenziato una stretta 
connessione tra l’IGS e l’attività della RNA polimerasi I. L’RNA polimerasi I è un enzima DNA 
dipendente e la sua funzione è quella di trascrivere il DNA in RNA (Singer e Berg, 1997). 
In Xenopus laevis lo spaziatore è delimitato verso l’estremità 3’ da una sequenza chiamata 
“promotore” e verso l’estremità 5’ dal segnale di terminazione di trascrizione che segue 
immediatamente l’estremità 3’ del gene dell’rRNA 25S. I promotori, detti anche promotori 
centrali, sono sequenze che vengono riconosciute e che si legano all’RNA polimerasi DNA 
dipendente durante l’inizio della trascrizione. Associate ai promotori esistono altre sequenze 
chiamate “intensificatori” che incrementano la trascrizione dei geni. Essi possono operare 
anche a diverse distanze dal promotore (Reeder, 1984) 
Lo studio condotto da Reeder chiarisce come è strutturato e quali sono le funzioni delle 
singole regioni che compongono l’IGS di questo anfibio. Nella parte destra dell’IGS ci sono 
diverse ripetizioni imperfette del promotore che sono state chiamate “isole di Bam” alternate 
ad elementi composti da 81 e da 60 bp ripetuti più volte. Gli elementi di 81 bp differiscono da 
quelli di 60 solo per le 21 coppie di basi in più. Negli elementi ripetuti di X. laevis è stata 
trovata una sequenza di 42 coppie di basi identica a quella presente nel promotore. Per 
questo gli elementi contenenti questa sequenza sono stati chiamati intensificatori. È stato 
 10 
provato che l’analogia esistente tra promotore ed intensificatori è connessa al complesso 
legante dell’rRNA polimerasi I. 
In esperimenti condotti su rDNA di mammiferi (ad esempio, uomo e topo) la delezione o la 
modifica del segmento comprendente il sito di inizio della trascrizione diminuivano o 
sopprimevano totalmente la trascrizione dell’rDNA. Mentre, ancora più a monte del 
promotore, esiste una zona ricca di sequenze ripetute che determina l’aumento dell’attività di 
trascrizione (Singer e Berg, 1997). 
In Drosophila melanogaster e D. virilis questi elementi ripetuti sono lunghi 
approssimativamente 240 bp e ciascuno di essi è in grado di promuovere un basso livello di 
trascrizione. Comunque la trascrizione comincia subito dopo la ripetizione più vicina al gene 
28S (Singer e Berg, 1997). 
In generale, anche in altri organismi sono presenti questi elementi ripetuti ed hanno 
lunghezza diversa. In Tabella 1 sono elencati gli elementi ripetuti appartenenti a diverse 
specie di organismi tra funghi, piante ed animali. 
 
Tabella 1. Confronto degli elementi ripetuti dell’IGS di specie diverse. 
Specie Coppie di basi Riferimento bibliografico 
Brassica nigra 21 e 106 Bhatia et al., 1996 
Cronartium ribicola 150 White et al., 1996 
Cucurbita pepo e C. maxima 260 King et al., 1993 
Daucus carota da 50 a 350 Taira et al., 1988 
Drosophila melanogaster 
240 Simeone et al., 1985 
D. virilis 250 Rae et al., 1981 
Eruca sativa 224, 22 e 30 Lakshmikumaran e Negi, 
1994 
Hebeloma cylindrosporum 6 Guidot et al., 1999 
Lycopersicon lycopersicon 53 e 141 Perry e Palukaitis, 1990 
Meloidogyne arenaria 129 Vahidi e Honda, 1991 
Neotyphodium lolii 40 e 111-119 Ganley e Scott, 1998 
Oryza sativa 264 e 253 Cordesse et al., 1993 
 11 
Phaseolus coccineus 162 e 176 Maggini et al., 1992 
Picea glauca 540 e 990 Beech e Strobeck, 1993 
Triticum spp. 30 e 172 Beech e Strobeck, 1993 
Verticillium alboatrum 18 Morton et al., 1995 
V. dahliae 81 e 101 Morton et al., 1995 
Vicia faba 325 Maggini et al., 1991 
Vigna radiata 174, 175, 180 Gerstener et al., 1988; 
Schiebel et al., 1989; 
Unfried et al., 1991 
Zea mays 200 Toloczyki e Feix, 1986 
 
 
 
In pomodoro ci sono due tipi di elementi ripetuti: uno di 53 ed uno di 141 bp. Questi 
hanno in comune una sequenza di 8 coppie di basi ma non sono state trovate analogie tra 
queste ed il sito di iniziazione di trascrizione (Perry e Palukaitis, 1990). Analogamente a 
Xenopus dove gli elementi ripetuti funzionano come intensificatori, anche nelle piante questi 
ultimi hanno un ruolo preciso nella regolazione della trascrizione. 
In Phaseolus coccineus lo spaziatore intergenico è stato diviso in tre parti: una regione A 
costante in lunghezza e ricca in AT; una regione B eterogenea in lunghezza e nella quale sono 
stati osservati due tipi di elementi ripetuti; una regione C costante in lunghezza e 
comprendente cinque isole, gli spaziatori del promotore ed il promotore (Marrocco et al., 
1998). 
Un altro esempio di organizzazione dello spaziatore intergenico è quello del lievito 
Saccharomyces cerevisiae dove sono state individuate tre zone diverse aventi le proprietà di 
influenzare l’attività di trascrizione: una di queste è una regione di 190 bp che stimola di circa 
dieci volte la trascrizione a livello del promotore funzionando da intensificatore (Singer e Berg, 
1997). 
Anche Schizosaccharomyces pombe, un altro lievito, possiede un tipo di organizzazione 
dello spaziatore intergenico simile a quella di S. cerevisiae, cioè priva di elementi ripetuti, ma 
che comunque contribuisce significativamente all’inizio della trascrizione a livello del 
promotore. In questo caso, quindi, è stata osservata la presenza di regioni paragonabili, come 
 12 
funzione, alle regioni degli elementi ripetuti di Xenopus, Drosophyla, topo etc. (Liu et al., 
1997). 
Nelle specie di lievito Saccharomyces e Schizosaccharomyces, inoltre, all’interno dell’IGS si 
trova un terzo gene: quello che codifica per l’rRNA 5S. L’IGS è così divisa in due parti 
solitamente chiamate IGS1 e IGS2. Tale organizzazione dello spaziatore intergenico si trova in 
altri funghi della divisione Ascomycota, Basidiomycota e Oomycota quali ad esempio Tuber 
aestivum, T. albidum, T. brumale, T. excavatum, T. ferrugineum, T. magnatum, T. 
melanosporum, T. rufum, T. uncinatum (Henrion et al., 1994), Gyromitra esculenta, Disciotis 
venosa, Verpa conica, Mitrophora semilibera, Morchella conica, M. crassipes, M. angusticeps, 
M. esculenta (Buscot et al., 1996), Pleurotus spp. (Iraçabal e Labarère, 1994; Bunyard et al., 
1996), Laccaria proxima (Albee et al., 1996), Puccinia hordei (Jennings et al., 1997), P. 
graminis (Kim et al., 1992), Schizophyllum comune (Buckner et al., 1988), Pythium ultimum 
(Klassen e Buchko, 1990), Phytophthora medicaginis (Liew et al., 1998),  
In Schizophyllum comune sono stati identificati degli elementi ripetuti di circa 100 bp che 
sono i responsabili della variazione di lunghezza dell’IGS1 all’interno degli isolati saggiati 
mentre in P. hordei non è stato trovato polimorfismo in lunghezza nella medesima regione 
(Jennings et al., 1997). 
Nell’ambito della stessa specie di un fungo generalmente la lunghezza dell’IGS è costante, 
tuttavia sono state anche osservate differenze di lunghezze intraspecifiche (Garber et al., 
1988; Buchko e Klassen, 1990; Fan et al., 1995; Subbarao et al., 1995; Faris-Mokaiesh, 
1996). 
In Tabella 2 sono elencate le lunghezze della regione IGS di diverse specie di funghi. Alcuni 
funghi, come già detto, hanno il gene per l’rRNA 5S nello spaziatore intergenico. In questo 
caso la lunghezza è riferita soltanto ad una delle due parti dell’IGS (IGS1 o IGS2). 
 13 
Tabella 2. Alcune stime di IGS appartenenti a funghi di specie diverse. 
1 
L’IGS è misurata in nt. 
2 
Il primer del 28S si attacca molto all’interno del gene. 
3 
Stima dell’IGS2, questi funghi hanno il 5S nello spaziatore. 
4 
Stima dell’IGS1, questi funghi hanno il 5S nello spaziatore. 
 
 
 
1.3. Impiego dell’IGS per studi di variabilità genetica nei funghi 
Al contrario dei geni ribosomali che sono regioni in cui sono presenti elementi con 
sequenza altamente conservata anche se appartenenti a specie ampiamente divergenti, lo 
spaziatore intergenico dell’rDNA sembra essere la regione che si evolve più rapidamente e per 
questo motivo è utilizzata come strumento di indagine della variabilità genetica dei funghi sia 
a livello intra che interspecifico.  
Specie IGS (bp) Fonte bibliografica 
Armillaria ostoyae 4800 Gardes et al., 1990 
Aschochyta spp. 2500-3500 Faris-Mokaiesh et al., 1996 
Cochliobolus heterostrophus 
 
9000-9150 Garber et al., 1988 
Colletotricum spp. 3000-3500 McCormick et al., 1995 
Coprinus cinereus 9300 Wu et al., 1983 
Cronartium ribicola 3700 White et al., 1996 
Cryptococcus neoformans 2421, 2480
1 
Fan et al., 1995 
Fusarium oxysporum 2600 Appel e Gordon, 1995, 
1996 
Neotypodium lolii 4300 Ganley e Scott, 1998 
Phytium spinosum 700 Martin, 1990
P. ultimum 4600-5800
2
 Buchko e Klassen, 1990 
Phytophthora medicaginis 3600
3
Liew et al., 1998 
Pleurotus spp. >4000
3 
Bunyard et al., 1996 
Podospora anserina 2060 Labat et al., 1985 
Sclerotinia homoeocarpa 4000 Hsiang e Mahuku, 1999 
Thanatephorus praticola 3580 Vilgalys e Gonzalez, 1990 
Tuber albidum 390, 430
4 
Henrion et al., 1994 
T. melanosporum 310
4 
Henrion et al., 1994 
Verticillium dahliae 1570  Morton et al., 1995 
V. dahliae 2100-2350 Subbarao et al., 1995