Effetti anti-aterosclerotici del licopene in cellule macrofagiche umane

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contribuiscono all’aterogenesi. E’ oggi accertato che alcune di queste molecole, chiamate 
ossisteroli, favoriscono la formazione della placca aterosclerotica attraverso l’induzione di processi 
citotossici, pro-ossidanti e pro-infiammatori. Gli ossisteroli costituiscono un’importante famiglia di 
molecole che si formano per auto-ossidazione del colesterolo all’aria, o per trasformazione 
enzimatica del colesterolo in alcuni tipi di cellule, o dalla perossidazione delle LDL [7]. E' 
ampiamente riconosciuto che gli ossisteroli giocano un ruolo chiave nell’aterosclerosi 
accumulandosi nelle arterie, a livello sub-endoteliale, durante la formazione dell’ateroma [8]. 
Infatti, nel plasma e nella placca aterosclerotica di pazienti ipercolesterolemici i livelli plasmatici  
degli ossisteroli sono stati trovati al di sopra della norma e tale aumento è stato recentemente 
associato con un aumento del rischio per l’aterosclerosi nell’uomo [9]. E’ stata inoltre dimostrata in 
molti studi l’abilità degli ossisteroli di scatenare reazioni citotossiche, pro-ossidative e/o pro-
infiammatorie, che sono i maggiori eventi coinvolti nella disfunzione vascolare e nell’aterosclerosi 
[10].  
Gli ossisteroli, soprattutto quelli con scheletro carbonioso C7 (come il 7-KC), aumentano la 
produzione di ROS, in particolare di anione superossido (O2·−) [11], e tutti, direttamente o 
attraverso un meccanismo ROS-mediato, inducono l’attivazione di NF-kB e aumentano 
l’espressione e la secrezione di citochine pro-infiammatorie, aumentandone i livelli trascrizionali e 
traduzionali. In particolare, nelle cellule vascolari endoteliali il 7-KC aumenta la secrezione di IL-1β 
[12], una citochina pro-infiammatoria, mentre il 25-OHC induce la secrezione di IL-8 (una citochina 
pro-aterogenica che modula l’adesione dei monociti alle cellule endoteliali del sistema vascolare) 
attraverso la cascata MEK/ERK1/2 [13]. Le differenze nell’azione biologica di questi due ossisteroli 
dipendono dalle loro proprietà fisiche e chimiche, che influenzano la loro distribuzione all’interno 
delle cellule, la loro interazione con i recettori e/o la loro abilità di modificare le strutture cellulari. 
Questi composti giocano un ruolo chiave principalmente nella trasduzione del segnale, quando si 
inseriscono nei lipid rafts della membrana plasmatica [14]. 
Studi epidemiologici hanno dimostrato che un alto consumo di pomodoro e prodotti da esso 
derivati, ricchi di licopene, è associato con un abbassamento del rischio di aterosclerosi e altre 
patologie cardiovascolari, ma il meccanismo di alcuni di questi benefici deve essere ancora chiarito. 
Si dà sempre più peso al ruolo dei processi immunitari e infiammatori nell’aterogenesi [15] e questo 
suggerisce che il consumo di composti potenzialmente immuno-modulatori e anti-infiammatori può 
inibire l’iniziale danno alle pareti delle arterie, soprattutto per una diminuzione della produzione di 
citochine [16]. In accordo con questa ipotesi, è stato trovato che un alto consumo di licopene, grazie 
alla sua capacità di modulare l’ambiente redox cellulare e l’interazione cellula-cellula, può essere 
inversamente correlato con la gravità dell’aterosclerosi, valutata dallo spessore della tunica intima e 
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media delle arterie [17]. L’ipotesi dell’inibizione della produzione di citochine da parte del licopene 
tramite un meccanismo redox è supportata da numerosi dati che dimostrano le proprietà redox del 
licopene, sia in vitro che in vivo, in molti sistemi biologici [18], sebbene siano stati riportati anche 
risultati che affermano il contrario [19]. Il licopene, grazie all’alto numero di doppi legami 
coniugati, neutralizza l’ossigeno singoletto con una forza superiore a quella del β-carotene e dell’α-
tocoferolo [20], e agisce come potente antiossidante, prevenendo il danno ossidativo a biomolecole 
importanti come lipidi, lipoproteine a bassa densità (LDL), proteine e DNA.  
Le citochine e le molecole di adesione cellulare rilasciate nell’infiammazione inducono 
l’espressione del fattore di trascrizione nucleare NF-kB che è implicato nell’ispessimento del vaso 
arterioso [22]. In diversi studi, sia in vitro che in vivo, il licopene (sia purificato che come 
supplementazione di pomodori o altri prodotti derivati del pomodoro) abbassa direttamente la 
produzione di citochine e, in una linea di cellule dendritiche , inibisce l’attivazione di NF-kB 
sequestrandolo nel citoplasma [23]. Inoltre, recentemente è stato dimostrato che il licopene modula 
pathways molecolari sensibili allo stato redox coinvolti nella proliferazione cellulare e nell’apoptosi 
[21].  
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 Capitolo 1 LICOPENE 
 
 
1.1 Introduzione 
 
Il licopene è un composto che fa parte della classe dei carotenoidi, i pigmenti naturali più 
abbondanti. Degli oltre 600 carotenoidi trovati in natura, circa 40 sono presenti in una tipica dieta 
umana. Ma solo 14 tra questi sono stati identificati nel plasma e nei tessuti umani con alcuni loro 
metaboliti [24]. Il licopene, responsabile della colorazione rossa di frutta e verdura, si trova 
principalmente nel pomodoro e nei suoi prodotti derivati, dove le concentrazioni possono variare da 
0.9mg/100g a 4.2mg/100g a seconda della varietà di pomodoro [25]. Il pomodoro appartiene alla 
famiglia delle Solanacee. L’attuale denominazione botanica Lycopersicon lycopersicum (L.) è 
quella introdotta dall’ISTA (International Seed Testing Association), ma per molto tempo a livello 
internazionale fu adottata la denominazione di Licopersicon esculentum. Il licopene è presente 
anche nel melone, nel pompelmo rosa, nella papaya, nella guaiava e nelle albicocche. Gli altri più 
importanti carotenoidi sono invece responsabili, per esempio, della colorazione arancio delle carote 
(β-carotene) e gialla delle calendule (violaxantina ed auroxantina), del mais (zeaxantina), dello 
zafferano (crocetina) e delle foglie autunnali (luteina).  
Oltre ad essere prodotti dalle piante, in cui sono presenti a tutti i livelli (dallo stelo al fogliame, ai 
fiori, ecc.), i carotenoidi sono sintetizzati anche da funghi, alghe e batteri. Nelle parti verdi dei 
vegetali il loro colore è mascherato da quello della clorofilla, presente in alte concentrazioni. A 
questa si affiancano nel processo fotosintetico proteggendo le cellule dall’attacco dei radicali liberi, 
che in questa fase si formano in abbondanza. Nelle piante la loro localizzazione subcellulare è 
quindi prevalentemente cloroplastica, dove sono generalmente complessati con proteine e grassi. 
Nei frutti acerbi i carotenoidi sono presenti in concentrazioni molto basse, ma aumentano durante il 
processo di maturazione, esibendo le loro tipiche colorazioni rosso, arancio e giallo. Anche lo 
Straphilococcus aureus, rinomato per la sua patogenicità e per la grande resistenza agli antibiotici 
acquisita negli anni, deve la sua colorazione gialla alla presenza di carotenoidi. Proprio dai 
carotenoidi presenti nel batterio sembra dipendere la sua resistenza all’attacco dei neutrofili del 
sistema immunitario: infatti, l’inibizione della sua carotenogenesi ne aumenta la sensibilità 
all’attacco ossidante [26]. I carotenoidi sono stati ritrovati anche in molti organismi animali. Tale 
presenza non sembra dovuta a una vera biosintesi, piuttosto si tratterebbe di una biotrasformazione 
dei carotenoidi assorbiti attraverso la dieta. Un tipico carotenoide trovato negli animali è 
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l’astaxantina, una xantofilla presente soprattutto negli animali acquatici e che, combinata con 
alcune proteine, è stata ritrovata in alcuni protozoi, crostacei, pesci e uccelli. 
Per la loro abbondanza in natura, per le diverse funzioni e le interessanti proprietà, i carotenoidi 
sono oggetto di ricerca interdisciplinare e suscitano notevole interesse nel campo della medicina e 
in molte altre branche della scienza. Le caratteristiche chimiche, biologiche e biochimiche dei 
carotenoidi sono molto osservate. Gli studi epidemiologici e i trials clinici sono ormai numerosi e 
confermano che una dieta a base di cibi ricchi di queste sostanze può essere considerata una forma 
di prevenzione verso molte patologie a carattere infiammatorio (comprese le infezioni) e croniche, 
come alcuni tipi di cancro e malattie cardiovascolari [27-30]. Ad ogni modo, molti meccanismi 
biologici alla base di questa azione protettiva tuttora rimangono sconosciuti. Esistono diverse 
possibili spiegazioni a riguardo: alcuni carotenoidi i) possono essere convertiti in retinoidi (per es. i 
precursori della vitamina A); ii) possono modulare attività enzimatiche, come quelle della 
lipossigenasi (per es. molecole pro-infiammatorie o anti-infiammatorie); iii) possono avere 
proprietà antiossidanti anche più potenti della vitamina A; e iv) possono attivare l’espressione di 
geni che codificano per proteine (come la connessina-43) essenziali alle gap junctions, le strutture 
molecolari indispensabili per la comunicazione cellula-cellula. L’attivazione di molti geni può 
essere comunque indipendente sia dalla capacità antiossidante che dall’attività di pro-vitamina A 
[31]. L’azione antiossidante dei carotenoidi è basata sulla loro proprietà di neutralizzare l’ossigeno 
singoletto (1O2) e sulla loro abilità a funzionare da trappola per i radicali perossilici [32]. Il 
licopene, grazie all’alto numero di doppi legami coniugati, neutralizza l’ossigeno singoletto con una 
forza superiore a quella del β-carotene e dell’α-tocoferolo [33] e agisce come potente antiossidante 
prevenendo il danno ossidativo a biomolecole importanti come lipidi, lipoproteine a bassa densità 
(LDL), proteine e DNA [34]. 
In aggiunta, molti dati indicano che i prodotti di ossidazione dei carotenoidi, soprattutto per gli 
analoghi dell’acido retinoico, contribuiscono significativamente a queste proprietà biologiche [35]. 
 
 
1.2 Caratteristiche chimiche  
 
Il licopene è un tetraterpene costituito da 40 atomi di carbonio e 56 atomi di idrogeno con una 
massa molecolare di 536 kDa (Fig. 1.1). Il licopene, come tutti gli altri carotenoidi, è un composto 
lipofilico solubile in tetra-idro-furano (THF), cloroformio, benzene ed etere, ed è praticamente 
insolubile in metanolo, etanolo ed acqua. Riscaldando il pomodoro in olio si aumenta 
l’assorbimento del licopene rispetto al suo assorbimento dal succo di pomodoro fresco [36]. Il 
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legame tra le attività biologiche del licopene e la sua biodisponibilità (intesa come il passaggio del 
composto nella circolazione sistemica dopo l’assorbimento intestinale) è stata confermata, per 
esempio, da Edward Giovannucci (professore di nutrizione ed epidemiologia all’Università di 
Harvard e maggiore studioso degli effetti del licopene sui tumori alla prostata) che ha studiato come 
gli effetti protettivi del licopene in pazienti con cancro alla prostata dipendano dalla sua 
biodisponibilità, e aumentino quando il pomodoro o i suoi prodotti derivati vengono cotti [37]. 
 
 
 
 
Figura 1.1 Formula di struttura del licopene. 
 
 
Il licopene ha un’assorbanza massima a 444, 470 e 502 nm (petroleum) che è caratteristica sia della 
colorazione rossa che della sua capacità di accettore di energia da molte specie elettronicamente 
eccitate [38]. L’intensità della colorazione dovuta al licopene, nei diversi sistemi biologici in cui è 
stato ritrovato, è data dalla presenza dei molteplici doppi legami coniugati, che formano un sistema 
cromoforico. Tale sistema di doppi legami è responsabile anche dell’instabilità chimica del 
licopene, che infatti si ossida facilmente all’aria ed è notevolmente modificato dalla presenza di 
acidi minerali e da reagenti elettrofili.  
Tutti i carotenoidi sono instabili e altamente reattivi contro l’ossigeno e i radicali liberi [39]. La 
reattività del licopene è alla base della sua attività antiossidante nei sistemi biologici, e contribuisce 
alla sua efficacia come agente chemo-preventivo. Il licopene è stabile solo in forma solida e nella 
matrice delle piante, ma dopo la sua estrazione dalla matrice e la seguente dissoluzione in solventi 
non-polari, il licopene perde la sua stabilità. Allo scopo di valutare la stabilità chimica del licopene 
nei solventi organici, Fang e i suoi collaboratori hanno sciolto il licopene in una miscela di metil-t-
butil-etere e acetonitrile (50:50, v/v), al riparo dalla luce e dall’aria. In queste condizioni il licopene 
ha mantenuto la sua stabilità per 16h a 4°C [40]. Usando un sistema modello con acqua, Henry ha 
misurato i tempi di degradazione di molti carotenoidi, trovando che il licopene è il più stabile tra 
quelli valutati. In queste condizioni sperimentali (una soluzione acquosa a 30°C) la stabilità del 
licopene si è mantenuta per circa 1h con l’ossigeno e per circa 5h nelle stesse condizioni 
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sostituendo l’ossigeno con l’azoto. Inoltre, in tali condizioni il licopene è risultato essere 8 volte più 
stabile del β-carotene [41].  Per ovviare al problema dell'instabilità del licopene sciolto in soluzione, 
si sono ideati nuovi modelli che vedono l’incorporazione di questo e di altri carotenoidi in perline, 
in vescicole liposomiali o in niosomi, tutti disperdibili in acqua. Tali sistemi possono stabilizzare 
molto i carotenoidi e potrebbero risolvere al contempo il problema relativo alla sicurezza 
dell’operatore nell’utilizzo di solventi organici di media e alta tossicità, come il THF, negli studi in 
vitro. 
La stereochimica del licopene è modificata da vari fattori. Nelle piante i doppi legami della struttura 
del licopene si trovano maggiormente in configurazione trans, che è la forma termodinamicamente 
più stabile [42]. Tuttavia, nel plasma umano il licopene è stato trovato come miscela di 
stereoisomeri, per il 50% costituita dall’isomero cis. [43]. Recenti studi hanno dimostrato che, nella 
cottura dei pomodori e dei suoi derivati, il calore induce l’isomerizzazione del licopene nella sua 
forma cis, ed è proprio in questa forma che il licopene viene maggiormente assorbito. Anche 
l’esposizione prolungata alla luce induce l’isomerizzazione del licopene in una struttura poli-cis 
[44]. Nel siero e nel tessuto prostatico umani sono state trovate alte concentrazioni dell’isomero cis 
del licopene e ciò suggerisce che le isomerasi tissutali provvedono in vivo all’isomerizzazione della 
forma trans nella forma cis [45]. Non è ancora completamente chiaro se l’isomerizzazione trans-cis 
sia un evento accidentale in vivo o al contrario se serva a qualche funzione precisa. Tuttavia, è certo 
che questo tipo di isomerizzazione è essenziale nei processi visivi sebbene ancora non si conosca 
che ruolo giochino tutti gli isomeri del licopene nella biologia umana. 
In un lavoro completato recentemente Venket Rao (professore di scienze della nutrizione 
all’università di Toronto) e Sanjiv Agarwal (urologo) hanno studiato su pazienti affetti da cancro 
alla prostata le concentrazioni di licopene nel siero e nel tessuto prostatico [46]. Ne è risultato che, 
rispetto al gruppo di controllo, questi presentavano livelli significativamente bassi di carotenoide. 
Una probabile spiegazione di tale fenomeno è che nei pazienti con cancro alla prostata manchi la 
capacità di isomerizzare il licopene proveniente dalla dieta. La conseguenza è che in questi soggetti 
l’assorbimento è notevolmente inferiore e si perdendo molti degli effetti benefici di questo 
composto. 
Oltre al licopene tutto-trans e tutto-cis, le più comuni forme isomeriche trovate sono il 5-cis, il 9-
cis, il 13-cis e il 15-cis, ma l’importanza biologica di questi isomeri rimane ancora sconosciuta.