Analisi comparativa e pattern di espressione del sottotipo istaminergico H3R nell’encefalo di Rettili e Uccelli

(Rogers et al., 2004). Tale caratteristica compare inizialmente con funzione di tipo 
percettivo-motorio nei Pesci e Rettili e si specializza in Uccelli e Mammiferi, nei quali una 
metà del SNC ed in particolare la parte sinistra diventa dominante nel controllo dell’azione 
ed è direttamente implicata nella categorizzazione delle esperienze laddove si richiedono 
risposte rapide ed appropriate, oltre al controllo del linguaggio (Vallortigara et al., 1999). 
Altre funzioni sono invece rimaste disponibili alla metà destra dell’encefalo, in particolare 
quelle connesse alla formazione di memorie di specifici episodi di esperienza, quali il 
riconoscimento individuale e la formazione di rappresentazioni spaziali dell’ambiente 
(Bisazza et al., 1998) 
Attualmente, sebbene l’encefalo dei Mammiferi sia stato ampiamente caratterizzato da 
un punto di vista morfologico, biochimico e neurofisiologico, pochi studi esistono sulle 
caratteristiche citoarchitettoniche e funzionali dell’encefalo dei Rettili e degli Uccelli. Per 
tale scopo, in una prima fase del presente lavoro di tesi è stata condotta un’analisi mirata alla 
descrizione delle caratteristiche morfologiche e morfometriche dell’encefalo di Rettili ed 
Uccelli, mettendo in luce i principali aspetti comparativi riscontrabili a livello delle aree 
telencefaliche, diencefaliche, mesencefaliche e cerebellari delle due classi di Vertebrati. Per 
tale scopo sono stati utilizzati come modelli sperimentali tessuti encefalici di Lacerta 
campestris, uno tra i Rettili più diffusi in Italia che presenta la maggiore capacità di 
propagazione e di adattamento ad ambienti estremamente diversi tra loro, e di Coturnix 
coturnix, un Galliforme dalle dimensioni molto ridotte, anch’esso largamente diffuso nel 
territorio italiano, adatto a vivere sia in pianura che in aree collinari. Per effettuare l’analisi 
comparativa dell’encefalo delle due specie, sono state utilizzate tecniche istologiche 
specifiche per tessuti neuronali, quale la colorazione di Nissl, al fine di ricostruire atlanti 
neuroanatomici rostro-caudali specifici per Lacerta campestris e Coturnix coturnix, 
considerato che attualmente non esistono informazioni citoarchitettoniche relative a tali 
specie in letteratura. L’attenzione è stata focalizzata prevalentemente sull’area telencefalica 
poichè numerose evidenze neuro-anatomiche suggeriscono l’esistenza di molteplici 
omologie tra il pallio laterale e dorsale dei Rettili ed il pallio laterale e l’area para-
ippocampale degli Uccelli (Striedter, 1997). Inoltre esiste un forte parallelismo funzionale tra 
la regione corticale mediale dei Rettili e l’ippocampo (Hp) degli Uccelli (Rodriguez et al., 
2002), in quanto entrambe direttamente implicate in funzioni complesse quali la memoria 
spaziale e l’apprendimento (Lòpez et al., 2001). Di notevole interesse risultano anche le 
caratteristiche evolutive del mesencefalo degli Uccelli rispetto a quello dei Rettili, in 
relazione alla maggiore espansione dei lobi ottici dei primi che sono funzionalmente correlati 
ad una maggiore acutezza visiva (Salas et al., 2003). Caudalmente, una struttura nervosa che 
si evolve nel passaggio da Rettili ad Uccelli è il Cb, una parte filogeneticamente antica del 
cervello che si è ingrandita notevolmente nel corso dell’evoluzione ed il cui volume è in 
stretta relazione con la vivacità dei movimenti del corpo e con la postura dell’animale e 
raggiunge la massima dimensione negli Uccelli e nei Mammiferi, in seguito alla formazione 
sulla sua superficie di molteplici folia e lobuli (Butler e Hodos, 2005). 
Sulla base di tali considerazioni, appare chiaro che le teorie evolutive che mettono in 
evidenza ipotesi di omologia tra le due classi dei Vertebrati prese in considerazione 
consistono di modificazioni morfostrutturali e citoarchitettoniche nell’organizzazione delle 
diverse regioni encefaliche, che si traducono in rilevanti cambiamenti nelle connessioni 
neuronali e nei meccanismi di cross-talking tra i principali sistemi di neurotrasmissione. Tra 
i sistemi neurotrasmettitoriali cerebrali, quello istaminergico costituisce uno dei sistemi più 
interessanti da un punto di vista evolutivo, in quanto deriva da un gruppo filogeneticamente 
antico di neuroni localizzato a livello dell’ipotalamo (HTH) posteriore rilascianti il 
neurotrasmettitore istamina (HA) e da cui dipartono fibre istaminergiche che innervano tutte 
le regioni encefaliche (Passani et al., 2006). La caratterizzazione del sistema istaminergico, 
sia dal punto di vista molecolare che funzionale, ha raggiunto la sua completezza nei 
Mammiferi (Leurs et al., 1995; Brown et al., 2001; Parmentier et al., 2006) ove modula 
numerose funzioni vitali, quali il bilancio energetico (Lin et al., 2000), il ciclo sonno-veglia 
(Leurs et al., 1998), la termoregolazione (Alvarez et al., 2001) e la neuroprotezione in 
seguito ad esposizione a tossine mitocondriali quali l’acido 3 nitropropionico (3-NPA) in 
grado di indurre fenomeni simil-ischemici (Canonaco et al., 2005). HA promuove i suoi 
effetti attraverso l’interazione con specifici recettori distribuiti in varie aree encefaliche, noti 
come sottotipi istaminergici H
1-3
R (Parson e Ganellin, 2006) e solo di recente è stato clonato 
anche un quarto recettore istaminergico, H
4
R, espresso principalmente su cellule del sistema 
ematopoietico e del sistema immunitario (Oda et al., 2000). Tra i diversi sottotipi recettoriali, 
H
3
R è considerato di particolare importanza sia per la sua localizzazione neuronale, che può 
essere presinaptica e postsinaptica a differenza degli altri recettori istaminergici che sono 
esclusivamente postsinaptici, sia per la sua funzione di autorecettore espresso in modo 
predominante a livello encefalico (Hancock et al., 2003). H
3
R è in grado di controllare il 
rilascio di HA ed inoltre esercita una funzione inibitoria su altri neurotrasmettitori in quanto 
è localizzato anche in neuroni che non sintetizzano HA (Lovenberg et al., 1999). Numerosi 
studi supportano il diretto coinvolgimento di H
3
R nella regolazione di molteplici 
comportamenti, come il feeding, la termoregolazione e la risposta allo stress (Haas e Panula, 
2003), oltre che nell’esplicazione di meccanismi neuroprotettivi in risposta a fenomeni di 
stress non solo di natura fisico-chimica ma derivanti anche da patologie neurodegenerative 
(Fox et al., 2005). 
Nei Vertebrati non Mammiferi le informazioni relative a tale sistema sono 
relativamente scarse, fatta eccezione per studi autoradiografici condotti in Rettili, Uccelli e 
Teleostei, che riportano un’eterogenea distribuzione delle fibre istaminergiche 
prevalentemente a livello delle aree telencefaliche e diencefaliche (Panula et al., 2000). Da 
un punto di vista molecolare, i recettori istaminerigici H
1-3
R sono stati recentemente 
caratterizzati in alcuni Teleostei quali Danio rerio (Peitsaro et al., 2007) e Thalassoma pavo 
nel quale tale sistema svolge un ruolo di notevole importanza nel meccanismo di regolazione 
della risposta allo stress (Giusi et al., 2007). Le informazioni relative al sistema 
istaminergico cerebrale nei Rettili sono molto scarse ed ottenute in Chinemys reevesii, i cui 
neuroni istaminergici sono stati trovati esclusivamente nella parte posteriore dell’HTH le cui 
fibre proiettano nella porzione mediale della corteccia cerebrale (Peitsaro et al., 2000), ma 
nessuna informazione è presente al momento sulla sequenza dei sottotipi recettoriali 
istaminergici in tale classe di Vertebrati. Tali recettori sono stati caratterizzati da un punto di 
vista farmacologico in una classe degli Uccelli appartenente all’ordine dei Galliformi 
utilizzando antagonisti selettivi per H
1
R (Zawilska et al., 2001) ed H
2
R (Zawilska et al., 
2002). La presenza di abbondanti fibre istaminergiche sono state prevalentemente ritrovate 
nell’HTH, ove promuovono la stimolazione della sintesi di cAMP negli Uccelli e tali effetti 
stimolatori possono essere antagonizzati da inibitori specifici di H
2
R, quali la ranitidina, la 
cimetidina e la zolantidina (Zawilska et al., 2005). Attualmente scarse sono le informazioni 
relative ad una funzione lateralizzata del sistema istaminergico nei Vertebrati, fatta eccezione 
per studi in cui si osserva che in seguito a somministrazione di agenti inibitori specifici della 
sintesi di HA, si ha una riduzione lateralizzata a livello dell’emisfero sinistro nell’efficienza 
dei processi di apprendimento e ricompensa nel ratto (Zimmermann et al., 1997). Inoltre 
l’azione di sistemi neurotrasmettitoriali direttamente implicati non solo nelle funzioni 
mnemoniche ma anche nel risveglio e nella regolazione della ritmicità circadiana esibiscono 
una specializzazione funzionale prevalentemente a livello dell’emisfero destro (Hopkins et 
al., 2006). 
Sulla base di queste considerazioni, in tale lavoro di tesi si è proposto di caratterizzare 
il sottotipo H
3
R nell’encefalo di Lacerta campestris e Coturnix coturnix, considerato che 
tutt’oggi non si conosce la sequenza codificante di questo recettore istaminergico nei Rettili 
e negli Uccelli. L’impiego di tali animali come modello sperimentale permette, dunque, di 
approfondire lo studio del sistema istaminergico in specie collocate in posizioni strategiche 
dal punto di vista evolutivo e colonizzanti habitat diversi mediante l’attuazione di sofisticati 
meccanismi adattativi. La caratterizzazione di un frammento parziale codificante per H
3
R in 
Lacerta campestris ed in Coturnix coturnix è stata condotta ricorrendo a tecniche quali la 
reazione a catena della polimerasi (PCR) preceduta da trascrizione inversa (RT). 
Successivamente sulla base della sequenza ottenuta, è stata disegnata, per ognuna delle due 
specie prese in considerazione, una sonda specifica per tale sottotipo recettoriale, mediante la 
quale attraverso ibridazione in situ (ISH) è stato possibile valutare la distribuzione 
dell’mRNA codificante per H
3
R in aree encefaliche critiche dal punto funzionale, 
focalizzando in particolare l’attenzione sulle regioni che mostrano una spiccata asimmetria 
funzionale tra emisfero destro e sinistro e pertanto una specializzazione nell’acquisizione di 
funzioni complesse lateralizzate. Le proprietà specifiche di affinità farmacologica di tale 
sottotipo in regioni cerebrali sia conservate evolutivamente che di nuova comparsa in Rettili 
e Uccelli, sono state analizzate mediante l’impiego dell’antagonista selettivo per tale 
recettore istaminergico, la tioperammide (Tio). Tale composto è un potente antagonista di 
H
3
R che agisce competendo in maniera specifica per il legame dell’agonista al recettore nelle 
diverse aree encefaliche, come dimostrato in molte specie di Mammiferi (Leurs et al., 1998; 
Canonaco et al., 2005) e Teleostei (Giusi et al., 2005; 2007), ove l’utilizzo di Tio è stato in 
genere associato a processi di degenerazione neuronale, disturbi nelle funzioni cognitive e 
deficit sensoriali e motori (Fox et al., 2005). 
I molteplici approcci metodologici affrontati in questo lavoro comprendono metodiche 
istologiche e morfometriche per lo studio delle proprietà citoarchitettoniche dell’encefalo di 
Lacerta campestris e Coturnix coturnix, oltre a metodiche biomolecolari e farmacologiche 
per la caratterizzazione del sottotipo H
3
R. I risultati rappresentano una prima evidenza 
sperimentale sul ruolo esplicitato dal sottotipo H
3
R in aree encefaliche direttamente correlate 
a funzioni vitali quali il feeding ed il movimento nei Rettili e negli Uccelli e che possono 
mostrare anche un’asimmetria funzionale, rivelando in tal modo nuovi aspetti molecolari e 
funzionali sul sistema istaminergico che rappresenta uno dei sistemi più importanti e 
conservati nel corso dell’evoluzione.