Il recettore periferico delle benzodiazepine nei neutrofili umani

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Le benzodiazepine 
Il termine benzodiazepine si riferisce alla parte della struttura chimica di questi 
farmaci, rappresentata da un anello benzenico (a) fuso con uno diazepinico (b). 
Tuttavia le benzodiazepine contengono anche un gruppo arilico (c) in posizione 5 
dell’anello diazepinico. (fig. 1) 
 
 
c
b
a
N
N
O
R
R
R
 
Fig. 1 
 
Suddividere le varie benzodiazepine in ansiolitiche, ipnotiche, anticonvulsivanti, 
e miorilassanti è improprio in quanto tutte le benzodiazepine hanno azione clinica 
qualitativamente simile; le loro differenze sono solo di tipo quantitativo e 
riguardano soprattutto l’aspetto farmacocinetico, l’emivita plasmatica, la rapidità 
di comparsa dell’azione, l’intensità e la durata di azione. E’ in base a quest’ultima 
caratteristica che vengono classificate in: 
A) Benzodiazepine a lunga durata d’azione 
B) Benzodiazepine a intermedia durata d’azione 
C) Benzodiazepine a breve durata d’azione 
D) Benzodiazepine a brevissima durata d’azione 
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Farmacocinetica 
Le benzodiazepine sono generalmente ben assorbite a livello gastroenterico, sono 
liposolubili ma scarsamente solubili in acqua. Si legano alle proteine plasmatiche 
ed in quanto liposolubili superano la barriera ematoencefalica. Dopo iniezione 
endovenosa l’effetto compare in un tempo che varia dai 15 secondi fino a qualche 
minuto a seconda della risposta individuale al farmaco, la durata di azione invece 
varia a seconda della liposolubilità del composto. Le benzodiazepine più 
liposolubili hanno una durata di azione più breve in quanto la loro struttura 
chimica ne favorisce una rapida distribuzione nei tessuti periferici, in particolare 
nel tessuto adiposo, quindi una più rapida eliminazione. I composti meno 
liposolubili invece si ridistribuiscono più lentamente restando più a lungo nel 
sistema nervoso centrale in concentrazioni efficaci. Questo fenomeno spiega 
l’apparente paradosso per cui, dopo somministrazione endovenosa di 
benzodiazepine, quella con emivita lunga abbia minor durata di azione di quella 
con emivita breve. 
 
Biotrasformazione ed eliminazione 
Le benzodiazepine vengono metabolizzate principalmente a livello epatico, 
attraverso processi di ossidazione e di coniugazione con acido glucuronico, dando 
vita a metaboliti attivi o, come nel caso della coniugazione, a metaboliti inattivi 
pronti per essere eliminati. L’eliminazione delle benzodiazepine avviene 
attraverso le urine ed in minor misura attraverso le feci. Le benzodiazepine a 
lunga emivita tendono ad accumularsi lentamente nel caso di trattamento cronico, 
così come lentamente vengono eliminate una volta sospesa la terapia. Quelle 
invece a breve emivita, tendono ad accumularsi in minore misura e, 
all’interruzione della terapia, vengono eliminate rapidamente. Queste 
caratteristiche farmacologhe comportano vantaggi e svantaggi 
contemporaneamente. Il fenomeno di accumulo che può verificarsi in seguito a 
trattamenti prolungati, porta ad un graduale aumento della concentrazione del 
farmaco nel sito di azione con conseguente incremento non solo degli effetti 
clinici, ma anche di quelli collaterali. Tuttavia questi effetti si manifestano 
soprattutto nella fase iniziale del trattamento e vengono in seguito compensati 
dalla tolleranza che si instaura nei confronti del farmaco. Inoltre le 
benzodiazepine hanno un alto indice terapeutico, che indica il rapporto tra dose 
efficace e dose letale, e difficilmente raggiungono concentrazioni tali da 
manifestare effetti tossici. 
 
Meccanismo di azione 
Il meccanismo di azione delle benzodiazepine è rimasto sconosciuto per più di un 
decennio dopo l’introduzione in terapia del capostipite, il Librium. Un 
 5
fondamentale passo avanti nella comprensione di tale meccanismo è stato fatto 
negli anni 1974-5, quando due gruppi di ricercatori, Costa e Haefely, offrirono 
evidenze biochimiche ed elettrofisiologiche che le benzodiazepine potenziavano 
l’azione dell’acido gamma amino butirrico,(GABA) il più importante 
neurotrasmettitore di tipo inibitorio del sistema nervoso centrale (S.N.C.). Il 
GABA è sintetizzato, contenuto e liberato dai neuroni gabaergici che sono 
interneuroni contenuti in tutto il S.N.C. Il GABA origina dall’acido glutammico 
ad opera di una glutammico decarbossilasi ed è immagazzinato all’interno di 
vescicole sinaptiche da cui viene liberato a seguito dell’ingresso di ioni cloro 
all’interno della terminazione nervosa in risposta al potenziale di azione. Il GABA 
agisce su specifici  recettori suddivisi in due principali sottotipi: GABA-A e 
GABA-B. 
Queste due classi di recettori non sono due subunità della stessa proteina ma 
costituiscono due distinte proteine. I recettori correlati al canale del cloro e al 
recettore delle benzodiazepine, sono i GABA-A. L’attivazione di questo recettore 
da parte del GABA o di farmaci Gabamimetici, determina l’apertura del canale del 
cloro favorendo il passaggio del cloro, secondo il gradiente elettrochimico, 
dall’esterno all’interno della cellula o viceversa. In molti neuroni la 
concentrazione degli ioni cloro è maggiore nello spazio extacellulare per cui 
l’apertura del canale determina un flusso di ioni verso l’interno con conseguente 
iperpolarizzazione della membrana. Al contrario a livello delle terminazioni 
nervose di diversi sistemi neuronali la concentrazione intracellulare del cloro è 
più alta che all’esterno, per cui l’apertura dei canali si traduce in un flusso verso 
l’esterno con conseguente depolarizzazione della membrana plasmatica. In questo 
caso, quando il potenziale di azione arriverà alla membrana depolarizzata, esso 
subirà una riduzione o una abolizione, il cui correlato funzionale sarà una ridotta 
liberazione di neurotrasmettitore. La conseguenza funzionale del GABA sui 
recettori localizzati sulle terminazioni nervose è inibitoria nonostante si attui 
attraverso una depolarizzazione. Le benzodiazepine si legano a siti specifici 
localizzati sulla membrana plasmatica di determinati neuroni e denominati 
recettori delle benzodiazepine. L’interazione delle benzodiazepine con il recettore 
si traduce in una modificazione allosterica del sito che comporta un aumento 
dell’affinità del GABA , in questo modo le benzodiazepine facilitano il legame del 
GABA con il suo recettore. L’interazione del GABA con il suo recettore produce 
l’apertura dei canali del cloro della membrana plasmatica e il passaggio degli ioni 
attraverso la stessa. Il recettore del GABA, quello delle benzodiazepine ed il 
canale del cloro costituiscono tre subunità, collegate funzionalmente, di un unico 
complesso sopramolecolare e cioè di una grossa proteina. 
 6
Caratteristiche del recettore benzodiazepinico 
Nel 1977, studi fatti usando [
3
H] diazepam portarono all’identificazione del 
recettore centrale delle benzodiazepine (CBR) nel cervello di topo (1) e, simili 
recettori, furono poi identificati nel cervello umano utilizzando [
3
H] 
flunitrazepam (2). Ulteriori caratterizzazioni farmacologiche basate sulla affinità 
per la triazolopiridazina, CL 218,872, portarono alla descrizione di due distinti 
recettori centrali (3). Il CBR1 ha un’affinità per il CL218,872 che è 5-10 volte più 
alta del CBR2; entrambi i recettori hanno localizzazione neurale, sono legati 
allostericamente con il recettore dell’ acido γ ammino butirrico (GABA) che 
regola il canale del cloro e modulano l’affinità dello stesso recettore (4). 
Attraverso clonazioni molecolari è stato dimostrato che il recettore del GABA 
appartiene a una famiglia di ligandi racchiusi nel canale del cloro di cui fanno 
parte i recettori nicotino acetilcolinici, i recettori del glutammato, e i recettori 
della glicina stricnino sensibili (5). Le diverse subunità che compongono il 
recettore del GABA sono responsabili della eterogeneità del CBR (6). 
Si riteneva che gli effetti clinicamente rilevanti, ansiolitico e anticonvulsivante, 
delle benzodiazepine fossero mediati esclusivamente da recettori localizzati nel 
sistema nervoso centrale. Inaspettatamente tessuti periferici di ratto usati come 
controllo negativo di esperimenti di binding mostrarono un alta affinità per il 
legame del [
3
H]diazepam. Questi siti periferici erano farmacologicamente distinti 
dai recettori centrali (1,3) e furono chiamati recettori delle benzodiazepine di tipo 
periferico (PBR). 
 Fin dalle prime descrizioni, l’accumulo di prove dalla farmacologia, dalla 
biochimica, dalla biologia molecolare, indicava che il PBR era solo lontanamente 
collegabile al CBR. Infatti il PBR in molte specie ha solo bassa affinità per le 
benzodiazepine e l’uso di tessuti periferici di ratto, dove invece è stata riscontrata 
un alta affinità, fu casuale. Studi successivi dimostrarono la presenza del PBR 
anche nel sistema nervoso centrale (7). 
 
Ligandi del PBR 
Diversi composti sintetici, inclusi chinoline, imidazoline, benzodiazepine, 
interagiscono reversibilmente con il PBR, alcuni di questi composti sono riportati 
in fig.2. Tutte e tre classi di ligandi sono inibitori competitivi reversibili, l’uno 
del legame dell’altro. Le benzodiazepine hanno bassa affinità per il PBR (ordine 
del micromolare) nella maggior parte delle specie ad eccezione dei roditori. 1,4 
Benzodiazepine come il flunitrazepam, diazepam, Ro5-4864, e clonazepam, furono 
utilizzate per caratterizzare il PBR nel ratto che ha un ordine di affinità 
paragonabile a quella del CBR (1,7).  
 7
O
N
Cl
N
CH3
NCS
CH3
11a
CH3
O
N
N
F
NO2
Flunitrazepam
N
N
NCS
O
Cl
Cl
AHN 086
N
N
Cl
N
O
CH3
CH3
Cl
Alpidem
N
CH3
CH3
N
CH3
O
NO2
F
PK 14105
N
Cl
N
O
CH3
CH3
CH3
PK 11195
N
N
CH3
Cl
Cl
O
Ro-54864
 
Fig.2 
 8
L’affinità delle benzodiazepine per il PBR di ratto è aumentata dall’alchilazione 
dell’azoto in posizione 1 degli 1,4 benzodiazepin 2-oni e, al contrario 
dell’interazione con il CBR, che discriminava tra gli enantiomeri in C3, 
l’interazione con il PBR non ha preferenze stereochimiche (8). 
L’ordine caratteristico della forza di legame delle benzodiazepine per il recettore 
periferico del ratto è, Ro 5-4864 > diazepam > flunitrazepam >>> clonazepam, le 
costanti di dissociazione stimate vanno da 6 nM per il Ro 5-4864 a più di 10 µM 
per il clonazepam. Nel ratto Il CBR è stereoselettivo ed ha l’ordine di legame 
inverso, con il clonazepam che mostra la maggiore affinità. Inoltre mentre il 
GABA aumenta l’affinità del CBR per le benzodiazepine, l’interazione con il PBR 
non è GABA dipendente. Il PBR nella maggior parte delle specie di non roditori, 
presenta verso le benzodiazepine un’affinità da moderata a molto bassa, per 
esempio il Ro 5-4864 ed il diazepam hanno un’affinità nell’ordine del 
micromolare per i recettori periferici bovini (9), ed una simile si ritrova anche nei 
tessuti umani (10). AHN 086 ed il flunitrazepam, benzodiazepine alchilate e 
fotoreattive che si legano al PBR del ratto, marcano diverse proteine con peso 
molecolare tra 30-35 kDa. [
3
H]AHN 086 un isocianato simile al RO 5-4864, 
diminuisce l’affinità delle benzodiazepine e modifica una proteina 30 kDa nel 
ratto ma non nelle ghiandole pineali di bovino (11). Il flunitrazepam marca delle 
proteine identificate nei mitocondri di ratto come una porina mitocondriale e un 
carrier dell’adenin nucleotide. 
Le isochinoline sono risultate utili in ulteriori caratterizzazioni del PBR. 
Diversamente dalle benzodiazepine che mostravano notevoli differenze nelle varie 
specie, il PK 11195, un isochinolina, ha un alta affinità per il recettore periferico 
di tutte le specie ed è diagnostico per il PBR (12). Mentre alcuni ligandi che 
interagiscono con il PBR reagiscono anche con il CBR, diverse chinoline come il 
PK11195, il PK 14105 ed il PK 14067/8 sono specifiche per il PBR. Il legame 
delle chinoline è stereospecifico infatti il PK14067 l’enantiomero levogiro della 
coppia di stereoisomeri, ha un’affinità molto maggiore dell’enantiomero 
destrogiro, PK 14068 (13). Dopo fotolisi il PK14105 un p-fluoronitro fenile simile 
al PK 11195, inattiva irreversibilmente il PBR e in particolare si lega ad una 
proteina di 17-19 kDa denominata la proteina di legame dell’isochinolina (IBP) 
(14). La IBP è un componente recettoriale presente in tutte le specie e non legato 
alla affinità per le benzodiazepine (9). 11a, un isocianato racemico simile al 
PK11195,  inibisce competitivamente il PBR ma la proteina alchilata non è stata 
ancora identificata (15). Termodinamicamente il PK11195 è stato classificato 
come un antagonista o un agonista parziale mentre il Ro 5-4864 come agonista 
basandosi rispettivamente sull’entropia e sull’entalpia prodotta dall’interazione 
ligando-recettore. Il significato funzionale della classificazione termodinamica è 
ambiguo poiché il PK11195 ed il Ro 5-4864 hanno simili effetti in diversi 
paradigmi fisiologici (13). Nei roditori il legame delle isochinoline e delle 
benzodiazepine al PBR può subire influenze diverse, indicando che questi siti 
 9
possono essere sovrapponibili ma non sono identici. Il dietilpirocarbonato 
(DEPC),che modifica selettivamente residui di istidina, inibisce il 70% dei siti del 
[
3
H]PK11195 mentre non ha effetto sul numero o sull’affinità dei siti del Ro 5-
4864 o sui rimanenti siti del PK11195 che risultano refrattari al DEPC indicando 
una eterogeneità del PBR a livello del dominio di legame dell’isochinolina. 
L’eterogeneità nella sensibilità dell’istidina alla modificazione chimica può essere 
una manifestazione di differenti conformazioni recettoriale. Tuttavia il PBR dei 
non roditori sembra essere insensibile al dietilpirocarbonato come quello della 
trota e quello bovino (12). L’interazione delle benzodiazepine è più facilmente 
influenzata da agenti chimici ed enzimi. La fosfolipasi A2 inibisce 
competitivamente il legame delle benzodiazepine e il suo effetto può essere 
mimato dalla mellitina, uno stimolatore l’isozima endogeno. I detergenti, i lipidi e 
gli acidi grassi, gli anioni e molti inibitori dei canali ionici (16),distruggono 
preferibilmente il legame con le benzodiazepine, ulteriore dimostrazione che i 
recettori delle benzodiazepine e delle isochinoline hanno differenti interazioni per 
i ligandi. Alpidem un imidazopiridina, ha un alta affinità,nel ratto e nell’uomo, sia 
per i recettori periferici che per i recettori centrali. Un’altra imidazopiridina, lo 
zolpidem, mostra una differenza di affinità tra il PBR dove è nell’ordine del 
micromolare, ed il CBR dove invece è nell’ordine del nanomolare. Alpidem 
sembra essere simile alle benzodiazepine in quanto l’affinità di legame è specie 
dipendente ed il composto si lega anche al CBR. La selettività recettoriale di 
imidazopiridine strutturalmente simili, può essere utile in futuro per dimostrare 
una relazione strutturale o funzionale tra recettore periferico e recettore centrale. 
Diversi composti endogeni strutturalmente diversi interagiscono con il PBR. I più 
noti sono gli acidi porfirino dicarbossilici, il DIAZEPAM BINDING INIBITOR 
(DBI) e diversi prodotti del suo processo, e la fosfolipasi A2. Di questi, le 
porfirine hanno la più alta affinità, in particolare la protoporfirina IX che si lega 
ai recettori in concentrazione nanomolare (17). Per inibire il legame del [3H] Ro 
5-4864 con il PBR, sono necessarie concentrazioni micromolari di DBI, un peptide 
di 9 kDa che inibisce il legame del diazepam con il CBR, e di 
triacontatertapeptide (TTN), un prodotto del processo del DBI (18). La densità di 
distribuzione del mRNA del DBI, è approssimativamente parallela alla 
distribuzione del PBR in diversi tessuti. Le concentrazioni delle porfirine e del 
DBI, compatibilmente con le loro rispettive affinità per il recettore periferico, 
hanno parte attiva nella analisi funzionale del PBR. Una proteina presente nello 
stomaco del ratto, purificata in base alla sua capacità di inibire il legame del 
[3H]Ro 5-4864, ha caratteristiche fisiche e attività strutturale identica ad una 
autentica fosfolipasi A2. Il significato fisiologico di questi ligandi endogeni è 
sconosciuto.