Tra le tecniche di immobilizzazione, l’adsorbimento, che consiste nelle
interazioni deboli (interazioni ioniche, legami idrogeno, forze di Van der Waals)
tra enzima e supporto, offre numerosi vantaggi quali:
• semplicità di realizzazione (semplice contatto tra soluzione proteica e
superficie del supporto);
• costo ridotto;
• preserva l’attività dell’enzima;
• offre la possibilità di riutilizzare le membrane dopo l’immobilizzazione
poiché quest’ultima si attua, come già detto, attraverso interazioni deboli,
quindi facilmente scindibili, tra enzima e supporto.
Il lavoro ha previsto la realizzazione di esperimenti di adsorbimento in un
primo momento in funzione della tipologia di supporto utilizzato, mantenendo
fissi gli altri parametri quali la concentrazione enzimatica e il tempo di contatto.
In un secondo momento, sono stati condotti invece, esperimenti in funzione del
tempo e della concentrazione, in modo da verificare la dipendenza
dell’adsorbimento dal tempo di contatto della soluzione proteica sulla membrana
e dalla concentrazione della soluzione stessa.
7
Capitolo Primo
Enzimi e loro meccanismo d'azione
In natura qualsiasi reazione chimica, necessaria alla vita di un organismo,
non potrebbe avvenire nei tempi ottimali alla realizzazione della vita stessa se
non esistesse qualcosa atto a velocizzarla. Assolvono tale funzione gli enzimi.
Un enzima è per definizione un catalizzatore dei sistemi biologici, di
natura proteica e con elevato grado di specificità per il suo substrato e agisce
abbassando l’energia di attivazione delle reazioni che catalizza, velocizzandole
senza subire alterazioni in concentrazione e funzionalità.
Ciò avviene grazie al fatto che gli enzimi creano un microambiente
specifico, cioè una tasca della molecola definita sito attivo, in cui una
determinata reazione risulta favorita energenticamente. La superficie di questo
sito è rivestita da residui amminoacidici i cui gruppi funzionali sono responsabili
del legame al substrato (la molecola sulla quale l’enzima esplica la sua azione da
cui ne risulterà un prodotto) e della catalisi della reazione in questione.
L’attività catalitica degli enzimi dipende dall’integrità della loro
conformazione proteica nativa. Infatti se un enzima viene denaturato o
dissociato in subunità perde la sua funzionalità.
Gli enzimi sono generalmente proteine globulari che in soluzione
assumono approssimativamente una conformazione sferica; il loro peso
molecolare può variare da 10.000 a milioni di Dalton. Nei casi più semplici la
molecola enzimatica è formata da una singola catena polipeptidica contenente
un centinaio di residui amminoacidici. In quelli più complessi, più catene
polipeptidiche, subunità, sono aggregate tra di loro.
La disposizione tridimensionale della catena polipeptidica, vale adire la
struttura terziaria, è alquanto specifica: i singoli residui amminoacidici si
8
vengono a trovare in posizioni ben definite, indispensabili per l’attività biologica
di tali molecole.
Informazioni dettagliate sulla disposizione degli atomi all’interno delle
molecole enzimatiche derivano da studi di diffrazione ai raggi X di enzimi in
forma cristallina: possono essere messe in evidenza infatti interazioni tra gruppi
polari ed interazioni tra gruppi idrofobi che sono responsabili della formazione
di zone ordinate all’interno della molecola. Oltre a ciò è possibile determinare le
interazioni che si instaurano tra enzima e substrato.
Una proprietà importante degli enzimi è la flessibilità della loro struttura.
L’origine di questa proprietà va ricercata nella relativa debolezza delle
interazioni idrofobiche e ioniche responsabili della specifica conformazione
spaziale delle catene polipeptidiche. L’associazione dei residui idrofobi
avviene in quanto questi residui tendono a non esporsi all’ambiente acquoso
rifugiandosi nelle porzioni interne della molecola, ove i contatti con l’acqua
sono minimizzati.
Alcuni enzimi esplicano la loro funzione catalitica utilizzando
esclusivamente la reattività dei loro residui amminoacidici. Altri invece
richiedono l’ausilio di componenti chimici addizionali definiti cofattori.
Il cofattore può essere costituito da un singolo ione inorganico oppure da
complesse molecole organiche o metallorganiche denominate coenzimi.
Lo ione metallico può fungere da ponte di legame tra substrato ed enzima,
oppure da gruppo catalitico. I coenzimi agiscono di norma come trasportatori
intermedi di elettroni o di gruppi funzionali specifici trasferiti durante la
reazione enzimatica. durante la catalisi non sono alterati in maniera irreversibile,
essi infatti, o rimangono inalterati, o vengono rigenerati, rimangono comunque
funzionali.
L’energia utilizzata per aumentare la velocità delle reazioni enzimatiche
deriva dalle interazioni deboli non covalenti (legami idrogeno, interazioni di van
der Waals, idrofobiche e ioniche) che si instaurano tra enzima e substrato nello
9
stato di transizione. Ciò spiegherebbe le grosse dimensioni che solitamente
hanno gli enzimi al fine di creare il maggior numero possibile di interazioni
deboli e guidare, così, la catalisi e la specificità d’azione nei confronti dei loro
substrati (Lehninger A.L., 1994).
Gli enzimi vengono classificati in sei classi, ognuna suddivisa in
sottoclassi in base al tipo di reazione chimica catalizzata (Lehninger A. et al.,
1994). Le classi sono :
1. transferasi, che catalizzano il trasferimento di gruppi funzionali da una
molecola all’altra;
2. ossidoriduttasi, che catalizzano reazioni di ossidoriduzione;
3. idrolasi, che catalizzano reazioni di idrolisi;
4. liasi, che catalizzano la rimozione o l’aggiunta di un gruppo ad un doppio
legame o altre scissioni che comportano riarrangiamenti elettronici;
5. isomerasi, che catalizzano riarrangiamenti intramolecolari;
6. ligasi, che catalizzano la fusione di due molecole.
Il metodo più importante con il quale si studiano gli enzimi e i loro
meccanismi d’azione è rappresentato dalla cinetica.
1.1 La cinetica enzimatica
Gli enzimi catalizzano le reazioni chimiche che avvengono negli
organismi viventi con modalità differenti da reazione a reazione, ma in tutti i
casi la catalisi procede attraverso la formazione di complessi tra l’enzima e i
reagenti. La più semplice reazione catalizzata da un enzima può essere cosi
rappresentata da:
E + S ↔ ES ↔ EP ↔ E + P
10
L’enzima E si combina con il substrato S per formare un complesso
enzima-substrato ES, che è poi trasformato in EP che si scinde in prodotto ed
enzima libero, che è nuovamente disponibile per reagire con un’altra molecola
di substrato.
Il processo può avvenire in maniera estremamente rapida: in molti casi
una singola molecola di enzima è in grado, in un secondo, di catalizzare la
trasformazione di migliaia di molecole di substrato in prodotto. La velocità di
una reazione catalizzata da un enzima può essere fino a 10
14
volte superiore alla
velocità della stessa reazione non catalizzata.
La velocità con la quale un enzima catalizza una reazione determina
l’attività dell’enzima stesso. In cinetica chimica, la velocità di reazione è
definita dalla quantità di sostanza che viene trasformata nell’unità di tempo.
Per una reazione, come quella su descritta, nella quale un substrato S si
trasforma nel prodotto P, la velocità V è determinabile sperimentalmente dalla
scomparsa di substrato –dS, o dall’aumento del prodotto di reazione dP, nel
periodo di tempo dt :
dt
dS
V
−
= oppure
dt
dP
V =
dove: -dS = quantità di substrato trasformato nel tempo dt,
dP = quantità di prodotto formato nel tempo dt.
L’attività catalitica degli enzimi dipende da diversi fattori tra loro
interdipendenti, ognuno dei quali può essere studiato ponendo costanti le altre
variabili.
Se in una reazione enzimatica viene mantenuta costante la quantità di
enzima mentre varia la concentrazione iniziale di substrato entro limiti
abbastanza ampi, si ottiene una relazione di tipo iperbolico tra velocità di
reazione e concentrazione di substrato (fig. 1.1). A basse concentrazioni di
substrato la velocità iniziale della reazione V
0
è proporzionale alla
concentrazione del substrato. Quando la concentrazione di substrato tende ad
11
aumentare, la velocità della reazione si avvicina asintoticamente ad una velocità
costante, raggiungendo un plateau nella curva. A questo punto la reazione si dice
di ordine zero rispetto al substrato ad indicare che l’enzima è stato saturato dal
suo substrato.
Figura 1.1 Cinetica di Michaelis-Menten che mette in relazione la velocità iniziale della
reazione con la concentrazione del substrato.
Nel 1913 Leonor Michaelis e Maud Menten postularono una teoria sulla
catalisi enzimatica che ha posto le basi per l’analisi quantitativa della cinetica,
applicabile nel caso semplice di una reazione ad un solo substrato come quella
fin qui descritta.
Secondo questa teoria l’enzima si combina al substrato per dare origine, in
maniera piùttosto rapida ad un complesso intermedio enzima-substrato [ES], con
elevata reattività, quindi estremamente transitorio:
ESSE
k
k
⇔
+
−
+
1
1
dove:
k
+1
= costante di velocità della reazione di formazione di [ES],
k
-1
= costante di velocità della reazione inversa.
12
Segue a questo punto una seconda tappa, che avviene in maniera più lenta
rispetto alla precedente, in cui il complesso [ES] si scinde in enzima libero e
prodotto della reazione P:
PEES
k
k
+
⇔
+
−
2
2
dove:
k
+2
= costante di velocità per la formazione del prodotto [P],
k
-2
= costante i velocità della reazione inversa.
Al tempo iniziale della reazione, la quantità di prodotto è molto bassa,
quindi possiamo assumere che k
-2
sia trascurabile. La reazione complessiva si
riduce a:
PEESSE
kk
k
++
⇔⇔
++
−
21
1
V
0
viene determinato dalla conversione di ES per dare origine al prodotto
e quindi dipende da [ES]:
][
20
ESkV ×=
+
(1.1)
Dato che il termine [ES] non è facilmente misurabile, è necessario trovare
un’espressione alternativa. Per tale ragione viene introdotto il termine [E
tot
] che
rappresenta la concentrazione totale di enzima dato dalla somma della quantità
di enzima libero ( [E
tot
] – [ES]) e di quello legato complessato al S.
Operando in condizioni in cui la concentrazione del substrato [S] è molto
più grande di [E
tot
], la quantità di substrato legata all’enzima diventa trascurabile
rispetto a quella totale.
13
Tenendo presenti queste approssimazioni, si può ricavare un’espressione
per V
0
contenente parametri facilmente misurabili, attraverso le seguenti tappe.
Tappa 1. Le velocità di formazione e demolizione del complesso ES sono
governate dalle costanti di velocità k
1
(formazione), k
-1
e k
2
(demolizione),
secondo le espressioni:
velocità di formazione di ES = k
1
([E
tot
] – [ES]) [S] (1.2)
velocità di demolizione di ES = k
-1
[ES] + k
2
[ES] (1.3)
Tappa 2. Bisogna fare ora un’assunzione importante, cioè che la velocità
iniziale della reazione rifletta uno stato stazionario in cui [ES] è costante; in
queste condizioni la velocità di formazione di ES diventa uguale a quella della
sua demolizione. Allo stato stazionario, quindi, le espressioni delle equazioni
(1.2) e (1.3) possono essere eguagliate:
k
1
([E
tot
] – [ES]) [S] = k
-1
[ES] + k
2
[ES] (1.4)
Tappa 3. Risolvendo ora l’espressione per [ES] si ottiene:
k
1
[E
tot
] [S] – k
1
[ES] [S] = (k
-1
+ k
2
) [ES] (1.5)
Aggiungendo il termine k
1
[ES] [S] a entrambi i lati dell’equazione e
semplificando, si ottiene:
k
1
[E
tot
] [S] = (k
1
[S] + k
-1
+ k
2
) [ES] (1.6)
Risolvendo questa equazione per [ES] si ottiene:
14
112
1
/)(][
]][[
][
kkkS
SEk
ES
tot
−
++
=
(1.7)
Se si semplifica ulteriormente, combinando le costanti di velocità in una
sola espressione si ottiene:
112
/)(][
]][[
][
kkkS
SE
ES
tot
−
++
=
(1.8)
Il termine (k
2
+ k
-1
) / k
1
rappresenta la costante di Michaelis-Menten e
viene riassunto come K
m
. Sostituendo tale termine nell’equazione 1.8, si ottiene:
][
]][[
][
SK
SE
ES
m
tot
+
=
(1.9)
Tappa 4. Ora V
0
può essere espressa in termini di [ES]. Sostituendo
l’equazione 1.9 nell’equazione 1.1 si ottiene:
][
]][[
2
0
Sk
SEk
V
m
tot
+
=
(1.10)
Poiché la velocità massima della reazione V
max
viene raggiunta quando
l’enzima è saturato con il substrato e quindi l’enzima del complesso attivato è
l’enzima totale [E
tot
], V
max
può essere definita come k
2
*[E
tot
]. Sostituendo
nell’equazione 1.10, questa può essere ulteriormente semplificata:
][
][
max
0
Sk
SV
V
m
+
=
(1.11)
Si ottiene così l’equazione di Michaelis-Menten che esprime la velocità di
una reazione catalizzata da un enzima con un solo substrato. Essa descrive
15
l’andamento della cinetica enzimatica in funzione della concentrazione del
substrato sul quale l’enzima agisce (Lehninger A.L., 1994).
Per confermare la veridicità di questa relazione si possono considerare i
casi limite in cui la concentrazione del substrato [S] sia molto alta o molto bassa.
1. [S] molto bassa Æ k
m
>> [S] Æ[S] al denominatore nell’equazione 1.11
diventa trascurabile Æ V
0
diventa una dipendenza lineare di [S]:
][
max
0
S
k
V
V
m
×=
2. [S] alta Æ [S] >> k
m
Æ k
m
al denominatore di 1.11 diventa trascurabile Æ
l’equazione si semplifica come:
max0
VV =
Ciò spiega il fatto che la velocità non aumenta quando la concentrazione
di substrato è elevata.
La curva in figura 1.2, assume un andamento che viene definito dai
termini
m
k
V
max
a bassa [S] e da
max
V ad alta [S].
Figura 1.2 Velocità iniziale della reazione
V
0
=V
max
[S]/k
m
16
Dall’equazione di M-M emerge un’importante relazione numerica nel
caso particolare che
max0
2
1
VV = Æ
][
][
2
maxmax
Sk
SVV
m
+
= (1.12)
Dividendo per V
max
si ottiene:
][
][
2
1
Sk
S
m
+
= (1.13)
Risolvendo per k
m
si ha che ][2][ SSk
m
=+
oppure ][Sk
m
= .
K
m
può essere, quindi, definita come la concentrazione di substrato alla
quale la velocità iniziale della reazione è pari alla metà della velocità massima.
Per meglio rappresentare i dati sperimentali l’equazione di M-M può
essere trasformata in altre forme come l’equazione di Lineweaver-Burk che si
ottiene dal reciproco di entrambi i membri dell’equazione di Michaelis-Menten:
][
][
][
1
maxmax0
SV
S
SV
k
V
m
+=
(1.14)
Mettendo in relazione in un grafico i valori di 1/V
0
in funzione di 1/[S] si
ottiene una linea retta con pendenza pari a k
m
/V
max
, un’intercetta sull’asse delle
ascisse pari a – 1/k
m
, e un’intercetta sull’asse delle ordinate pari a 1/V
max
.
Figura 1.3 Grafico di Lineweaver-Burk o dei doppi reciproci
1/V
0
1/[S]
1/V
max
-1/k
m
max
0
]/[1
/1
V
k
S
V
Pendenza
m
==
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