Effetto della somministrazione di caffeina sui recettori A2A dell'adenosina in neutrofili umani

Una volta formatasi, l’adenosina può uscire dalla cellula attraverso la membrana 
cellulare per diffusione facilitata, cioè utilizzando una proteina di trasporto, 
coinvolta in un processo bidirezionale dipendente dalla concentrazione. Questo 
trasporto è inibito dalla dinitrobenziltioinosina e dal dipiridamolo. 
L’adenosina extracellulare deriva dall’ATP rilasciato per esocitosi o attraverso un 
trasportatore specifico di membrana. L'ATP viene poi inattivato nello spazio 
extracellulare ad ADP, AMP ed adenosina grazie all’intervento di ectoenzimi 
(Dunwiddie et al., 1997; Shrier et al., 2001). La defosforilazione dell’adenosina da 
parte della ecto-5’-nucleosidasi sembra essere un passaggio limitante: usando un 
inibitore di questo enzima su striato di ratto, questo diminuisce i livelli normali di 
adenosina (Delaney & Geiger, 1998). 
La formazione di adenosina intracellulare è importante quanto la sua formazione 
dalla rottura dell’ATP extracellulare. 
L’inattivazione dell’adenosina può avvenire prevalentemente attraverso tre vie:  
1- la deaminazione ad inosina attraverso una adenosina deaminasi, la cui 
affinità per l’adenosina è di 20-100 μM; questo processo può avvenire sia 
all’interno che all’esterno della cellula grazie all’endo- e all’eso-adenosina 
deaminasi; 
2- la fosforilazione catalizzata da una adenosina-chinasi, la cui affinità è di 0.2-
2 μM; questo processo avviene dopo la ricaptazione dell’adenosina 
all’interno della cellula grazie ad un trasportatore nucleosidico; 
3- una reazione con L-omocisteina grazie ad una idrolisi che porta alla 
formazione di S-adenosilomocisteina. 
Un meccanismo efficiente di ricaptazione è importante nell’inattivazione 
dell’adenosina, essendo tutti gli enzimi responsabili del catabolismo localizzati a 
livello citoplasmatico e la sua rilevanza è sottolineata dal fatto che forti inibitori del 
trasporto nucleosidico come la dinitrobenziltioinosina, il dipiridamolo e la 
papaverina potenziano le funzioni dell’adenosina sull’attività motoria, nocicettiva, 
ipnotica, convulsivante e neuronale (Bruns et al., 1991).  
L’adenosina ricaptata viene poi fosforilata ad AMP grazie ad una adenosina-chinasi 
intracellulare, che consente il riciclo del pool cellulare di purine. 
 5
Grazie alla microdialisi sono state determinate le concentrazioni fisiologiche di 
adenosina, che sono di 30-300 nM, sufficienti per attivare i recettori A
1
 e A
2A
 
(Fredholm et al., 2001a). I livelli di adenosina sono significativamente più alti 
durante lo stato di veglia che nel sonno ed  aumentano fino a centinaia di volte 
come risultato di uno stress ossidativo (Rudolphi et al., 1992). Infatti in queste 
condizioni, a causa dell’incrementato utilizzo dell’ATP intracellulare, si ha anche 
un notevole aumento della produzione di adenosina che attraversa lo spazio 
extracellulare per semplice diffusione. In condizioni ischemiche, cioè in mancanza 
di ossigeno, invece la concentrazione può aumentare da un minimo di 10 fino ad 
oltre 1000 volte. In condizioni di emergenza, il rilascio di purine avviene da 
qualunque tipo cellulare danneggiato dall’insulto ischemico/ipossico come ad 
esempio da cellule endoteliali, da globuli rossi e da piastrine. Si può ipotizzare 
l’esistenza di un meccanismo di difesa che permette l’attivazione contemporanea di 
più processi necessari per il ripristino della funzionalità cellulare e di una normale 
omeostasi dell’ossigeno. 
 
N
N
N
N
NH
2
H
H
OH
OH
O
HO
 
 
 
 
 
 
 
 
Figura 1 - Adenosina 
 
 
 
 
 6
RECETTORI ADENOSINICI 
 
L’adenosina extracellulare è in grado di modulare la funzionalità cellulare 
esercitando il suo effetto in seguito al legame e all’attivazione di specifici recettori 
di membrana.  
I recettori adenosinici appartengono alla famiglia dei recettori purinergici, suddivisi 
in due classi denominate P
1
 e P
2
 in base alla maggiore selettività e al diverso ordine 
di potenza dei nucleotidi/nucleosidi purinici (Ralevic & Burnstock, 1998). L’ordine 
di potenza per i P
1
 è: Adenosina > AMP > ADP > ATP, mentre per i P
2
 è: ATP > 
ADP > AMP > Adenosina. I recettori P
1
 comprendono i recettori dell’adenosina. I 
P
2
 sono più sensibili all’ATP e ai nucleotidi correlati e sono suddivisi 
prevalentemente in P
2X
 (recettori canale) e in P
2Y
 (recettori accoppiati a proteine G) 
(Burnstock, 2006). 
A tutt’oggi sono stati identificati e caratterizzati farmacologicamente quattro diversi 
recettori dell’adenosina, tutti presenti a livello della membrana e accoppiati a 
proteine G e secondo la nomenclatura IUPHAR vengono distinti in quattro sottotipi 
denominati A
1
, A
2A
, A
2B
 e A
3
 (Fredholm et al., 2000; 2001a; 2003a) (Fig. 2). 
I recettori adenosinici sono stati clonati in numerosi tessuti derivati sia da specie 
animali che dall’uomo (Fredholm et al., 2001b) e sono stati identificati attraverso 
una serie di dati ottenuti da studi molecolari, biochimici e farmacologici. 
Tutti i recettori dell’adenosina sono associati alle proteine G, che sono elementi 
essenziali in molti sistemi di trasmissione del segnale attraverso la modulazione di 
specifiche attività enzimatiche. Le proteine G sono associate alla superficie 
citoplasmatica della membrana e sono eterotrimeri composti da tre subunità distinte 
in α, β e γ. La subunità α è quella che lega il GTP, che ha attività GTPasica 
intrinseca e che quindi idrolizza il GTP a GDP.  
I recettori accoppiati alle proteine G hanno una struttura putativa formata da 7 α-
eliche anfipatiche transmembrana; ciascuna è costituita da circa 21-28 amminoacidi 
idrofobici. L’estremità N-terminale è posizionata a livello extracellulare e presenta i 
siti di glicosilazione, importanti nella formazione del legame farmaco-recettore. 
 7
L’estremità C-terminale si trova sul lato citoplasmatico e presenta i siti di 
fosforilazione, coinvolti nel disaccoppiamento del recettore con la proteina G.  
L’analisi della struttura ha riferito l’importanza dei ponti disolfuro per la 
conformazione recettoriale (Jacobson et al., 1993). Il ruolo della N-glicosilazione 
che avviene sul secondo anello extracellulare non è ben chiaro, anche se potrebbe 
indurre la stabilizzazione della conformazione della proteina e la protezione da varie 
proteasi. La glicosilazione, secondo le attuali evidenze, non ha influenza sul 
“binding” dei ligandi (Piersen et al., 1994).  
L’attivazione del meccanismo di trasduzione del segnale intracellulare è mediata 
dall’interazione del segmento intacellulare del recettore con specifiche proteine G. I 
residui localizzati entro le regioni transmembrana sono cruciali per il “binding ” dei 
ligandi. Il sito di legame con la proteina G è formato dalla III ansa intracellulare in 
combinazione con il territorio carbossiterminale, e questo legame avviene quando 
l’agonista si lega al recettore e lo attiva. 
I recettori adenosinici presentano una diversa affinità per gli agonisti endogeni, una 
diversa specificità farmacologica e un diverso modo di trasdurre il segnale. I 
recettori A
1 
e A
2A 
 sono ad alta affinità, in quanto attivati da concentrazioni 
nanomolari di adenosina, mentre i recettori A
2B
 e A
3
 sono a bassa affinità perché 
attivati da concentrazioni micromolari di adenosina (Klinger et al., 2002). 
Sono stati inoltre evidenziati nella corteccia cerebrale dei siti di legame di tipo non 
recettoriale detti “adenotin binding sites” (Schwabe et al., 1993), presenti anche 
nelle piastrine (Varani et al., 1996) e nella placenta umana (Hutchison et al., 1990). 
Questi siti fanno parte di una proteina di 98 kDa che ha omologia con le proteine da 
stress (termica, metabolica, da infezione virale) e che impedisce la caratterizzazione 
diretta dei recettori A
2A
 periferici mediante misure di “binding” recettoriale 
(Hutchison et al., 1990). 
 
 
 
 8
RECETTORI A
1
 
I recettori A
1
 sono stati purificati diverse specie, tra cui uomo, ratto, bovino, 
coniglio, sono stati clonati, sequenziati, espressi e sono risultati essere caratterizzati 
da massa molecolare di 32 KDa, formati da 326 aa (Libert et al., 1992) ed il gene 
del recettore umano (ADORA1) è stato localizzato nel cromosoma 1q32.1. 
Questo sottotipo recettoriale presenta uno o due siti di glicosilazione sul secondo 
dominio extracellulare, un sito potenziale per l’acetilazione degli acidi grassi sulla 
coda carbossilica, alcuni siti di fosforilazione e un “cluster” di residui di Serina e 
Treonina sulla porzione C-terminale (Linden et al., 1991).  
Questi recettori sono accoppiati a proteine G
0
 e G
i
 e mediano l’inibizione 
dell’adenilato ciclasi, l’aumento della conduttanza al potassio e la riduzione della 
conduttanza al calcio (Freissmuth et al., 1991; Munshi et al.,1991). La subunità α 
svolge un ruolo importante nell’attivazione dei canali per il potassio, mentre il 
dimero βγ ha come azione principale l’inibizione dell’adenilato ciclasi.  
I recettori A
1 
hanno un’ampia distribuzione sia a livello centrale che periferico 
(Dhalla et al., 2003; Schindler et al., 2005). Nel sistema nervoso centrale sono 
presenti ad alte concentrazioni nella corteccia, nel cervelletto, nelle zone dendritiche 
dell’ippocampo, nel genitacolo mediale e nello strato superficiale del collicolo 
superiore (Rebola et al., 2003). A concentrazioni inferiori sono stati trovati nello 
strato granulare cerebellare, nel nucleo septale laterale, nei corpi mammillari, nel 
nucleo accumbens, nel caudato putamen, nella sotanza nigra e in alcuni nuclei 
talamici. A livello periferico sono localizzati in cuore, polmoni, stomaco, fegato, 
milza, vaso deferente, testicoli, tessuto adiposo bianco, vescica e neutrofili 
(Gottlieb, 2001; Spicuzza et al., 2006). 
 
 
 
 
 
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