Studio di processi di osteointegrazione mediante diffrazione di raggi X

iv INDICE
impianto artificiale senza tessuto connettivo apparente.
Il successo di un impianto e` determinato dallo sviluppo e dalla qualita` del tessuto
osseo in presenza di biomateriali e la conoscenza accurata della risposta del tessuto
osseo nelle regioni di perimpianto risulta cruciale per selezionare i biomateriali otti-
mali per migliorare il successo a lungo termine degli impianti e per evitare i difetti di
osteointegrazione che creano sofferenza nei pazienti.
Varie tecniche come la radiografia a raggi X [Bagnal et al.,1977; Baleggi et.al., 1993];
l’istologia [Gray at.al., 1995; Nobackar and Robertson, 1951]; la sonografia [Filly et.
al., 1987; Budorick et. al. 1991; Wally at. al., 1999]; calcolo tomografico [Brillon
et. al., 1996] sono state usate per verificare lo sviluppo morfologico dell’osso e la sua
densita` mineraria durante la sua formazione. Queste tecniche pero` danno informazioni
essenzialmente macroscopiche e nessuna di esse e` in grado di descrivere accuratamente
l’organizzazione microscopica dell’osso calcificato.
Tecniche invece come la diffrazione a raggi X caratterizzano la struttura cristallografi-
ca del tessuto osseo. La tecnica di diffrazione a raggi X e` una sonda su scala atom-
ica che da` informazioni sulla qualita` microscopica del tessuto osseo, come lo stato di
mineralizzazione e le fasi cristallografiche coinvolte.
In questo lavoro la tecnica di diffrazione da radiazione da sincrotrone (SR-XRD) e`
stata usata per esaminare accuratamente la natura cristallografica del tessuto osseo
nella regione circostante gli impianti al titanio al fine di studiare il processo di osteoin-
tegrazione, monitorando i cambiamenti nella microarchitettura che avvengono nelle
prime fasi di formazione ossea attorno agli impianti. L’uso della radiazione di sin-
crotrone come sorgente di raggi X risulta utile ai nostri scopi in quanto il suo alto
flusso fotonico consente di ottenere immagini con un’alta risoluzione spaziale; l’acqui-
sizione dei dati avviene in tempi estremamente ridotti; la raccolta dei diffrattrogrammi,
di alta qualita`, si ha con un ampia statistica e tempi brevi di misura.
Gli esperimenti SR-XRD sono stati condotti sulla linea GILDA dell’ESRF di Grenoble
(Francia). I campioni di osso con titanio sono stati preparati in sottili fette ed i
diffrattrogrammi sono stati raccolti in funzione della distanza dall’impianto usando uno
spot size sul campione di 100× 100µm2. I diffrattrogrammi sono stati acquisiti usando
un set-up 2D a dispersione angolare basato su un rilevatore a larga area ”imaging plate”,
adeguato per un raffinamento strutturale accurato ed una analisi sulla ”texture” delle
particelle di osso mineralizzato.
L’analisi quantitativa dei diffrattrogrammi XRD e` stata effettuata con metodo Rietveld
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mediante l’uso del programma di calcolo GSAS. Tale metodo consente di effettuare
l’analisi quantitativa dei campioni multifase (fase di idrossiapatite e dove presente fase
di Titanio) e di ottenere informazioni accurate riguardo la struttura dell’osso nelle re-
gioni prossime all’impianto (osso giovane, non completamente calcificato) e nelle regione
lontane (osso vecchio, calcificato).
L’obiettivo, quindi, e` di capire -dal confronto dei risultati sperimentali dei diversi
campioni- se nell’arco del tempo (∼ 2 mesi, ∼ 1 anno) in cui gli impianti sono rimasti
inseriti nell’osso (dell’anca e della mascella) si siano verificate modifiche strutturali ri-
levanti, in particolare, all’interfaccia osso/impianto, allo scopo di dimostrare il corretto
(o non corretto) processo di osteointegrazione.
La tesi e` articolata in quattro capitoli: nel primo descriviamo le proprieta` del tessuto
osseo e del biomateriale in esso inserito (impianto al titanio) focalizzando la trattazione
sul processo di rimodellamento osseo; nel secondo analizziamo in dettaglio la teoria della
diffrazione a raggi X da polveri spiegando in particolare il processo di diffrazione da
polveri; nel terzo capitolo discuteremo l’apparato sperimentale con cui i dati vengono
raccolti ed il metodo di analisi utilizzato per studiare i diffrattrogrammi acquisiti;
infine nell’ultimo capitolo descriviamo i risultati della nostra analisi traendo le adeguate
conclusioni.
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Capitolo 1
Osteointegrazione
In questo capitolo descriviamo la struttura e la composizione dell’osso; gli impianti al
titanio inseriti nei campioni di osso da noi analizzati e il motivo della loro applicazione;
le modifiche subite dalla struttura ossea dopo l’inserimento degli impianti mostrando i
progressi dei processi di osteontegrazione.
1.1 Il tessuto osseo
Il tessuto osseo e` un sistema dinamico le cui cellule sono soggette a continuo rimodel-
lamento e rinnovamento per l’intera durata della vita.
Dal punto di vista microscopico, il tessuto osseo e` composto da un tessuto connettivo
formato da cellule specializzate (preosteoblasti, osteoblasti, osteociti, osteoclasti); da
fibre extracellulari (collagene); da una sostanza intercellulare, con la peculiarita` speci-
fica di essere mineralizzata: infatti, la sostanza intercellulare e` per la maggior parte
costituita da cristalli minerali, in prevalenza fosfati di calcio. Il tessuto osseo e` al-
lora costituito da una componente organica, l’osseina, e da sostanze inorganiche. La
componente organica, formata dalle cellule e dalla sostanza intercellulare non minera-
lizzata, conferisce all’osso la particolare elasticita` e resistenza alla trazione mentre, la
componente inorganica composta principalmente da fosfato e carbonato di calcio sotto
forma di aghi sottili (cristalli di idrossiapatite) insieme con le fibre di collagene, gli
attribuisce la particolare durezza e rigidita` a tutti ben note.
Tra le cellule specializzate del tessuto osseo si distinguono gli osteoblasti e gli osteo-
clasti. Gli osteoblasti sono cellule di origine mesenchimale1 di forma tondeggiante e
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Il mesenchima e` il tessuto connettivo embrionale che da` origine per successive fasi di sviluppo al
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2 CAPITOLO 1. OSTEOINTEGRAZIONE
villoso, la cui funzione e` quella di sintetizzare le varie componenti tessutali sia fibrose
che amorfe e, tramite la regolazione biochimica della sostanza intercellulare, di favorire
la deposizione dei sali di calcio. Nelle fasi di minor attivita`, gli osteoblasti si trasfor-
mano in osteociti: riducono le dimensioni del loro citoplasma, assumono una forma
allungata o fusata e vengono accolti all’interno di lacune della sostanza fondamentale
(matrice ossea). Gli osteociti non sono cellule in totale quiescenza, ma, anche nell’osso
adulto, continuano a regolare la formazione dell’osso nel processo del rimaneggiamento
osseo. In condizioni specifiche, inoltre possono ritornare a svolgere una sintesi attiva
trasformandosi in osteoblasti.
Gli osteoclasti, sono cellule molto grandi, con diametro variante tra i 20 e 100 micron.
Gli osteoclasti sono generalmente accolti in lacune dette Howship ed operano il rias-
sorbimento del tessuto osseo che svolge un ruolo importante nel corso dei processi di
rigenerazione e rimodellamento del tessuto osseo.
L’organizzazione generale del tessuto osseo ci permette di riconoscere un tessuto osseo
di tipo fibroso ed un tessuto osseo di tipo lamellare. Il tessuto osseo fibroso, a fibre
intrecciate, e` caratterizzato dalla presenza di un abbondante quantitativo di fibre di
collagene (5−10µm di diametro) che, senza un orientamento regolare e definito formano
una rete di fibre simile ad una serie di ragnatele intrecciate nelle tre dimensioni dello
spazio. Il tessuto osseo lamellare, invece, e` a sua volta suddivisibile in un osso spugnoso
ed in osso compatto. L’osso spugnoso e` caratterizzato da lamelle ossee distanziate
tra di loro e variamente intrecciate, mentre il tessuto osseo compatto e` costituito da
lamelle giustapposte e tra loro parallele. La caratteristica dell’osso compatto e` la
presenza di strutture, formate da vasi sanguigni circondati da numerose lamelle ossee,
che costituiscono una struttura a forma di cilindro: il cosiddetto osteone o sistema di
Havers. Lo spazio centrale dell’osteone e` occupato da un vaso sanguigno, intorno al
quale e` organizzato il tessuto osseo: canale di Havers (vd. fig.1.1).
Gli osteoni si sviluppano lungo la direzione longitudinale a forma di manicotti. Fra i
vari osteoni cilindrici, disposti principalmente lungo la direttrice principale dell’osso,
sono reperibili le lamelle interstiziali, che riempiono, appunto gli interstizi liberi tra un
cilindro osteonico e l’altro. I canali di Havers contigui possono essere uniti tra loro da
tratti trasversali, situati all’interno di canali scavati nel tessuto lamellare, i cosiddetti
canali di Volkmann.
Il tessuto osseo e` un tessuto metabolicamente molto attivo in cui si hanno continui
tessuto connettivo adulto
1.1. IL TESSUTO OSSEO 3
Figura 1.1: Sezione di osso. Gli osteoni corrono paralleli alla struttura; essi sono attraversati nella
loro lunghezza dai canali di Havers in cui scorre il capillare sanguigno. I canali di Havers sono collegati,
trasversalmente, tra loro, mediante i canali di Vokmann.
processi di riassorbimento e di deposizione ossea. Le modificazioni continue a cui va
incontro questo tessuto vengono indicate con il termine di ”rimaneggiamento osseo”:
esso e` il risultato di fenomeni di riassorbimento e deposizione di osso rilevabili mi-
croscopicamente, ma che non comportano cambiamenti macroscopici della forma del
segmento osseo coinvolto dal rimaneggiamento. Le cellule che partecipano all’azione
dinamica del rimaneggiamento sono proprio le quattro cellule specializzate del tessuto
connettivo. I preosteoblasti vengono reclutati dal sangue e poi indotti a differenziar-
si in osteoclasti; gli osteoclasti disgregano la matrice ossea digerendo il tessuto nella
zona in cui l’osso deve subire le modificazioni creando cos`ı una cavita` di riassorbimen-
to. Nel frattempo subentra l’azione degli osteoblasti i quali aderendo alla parete della
cavita` di riassorbimento cominciano a depositare nuovo tessuto osseo per garantire il
rimodellamento.