Introduzione
limite massimo fissato dalla legislazione italiana nelle olive è di 0.04
mg/Kg. La tecnica di spettrometria di massa Elettrospray ionization (ESI) è
stata utilizzata per studiare la frammentazione del rotenone e di alcune
molecole derivate e per mettere a punto un metodo di determinazione
quantitativa basato sul monitoraggio di una transizione MRM. Come
standard interno è stato utilizzato un cicloaddotto ottenuto mediante sintesi
che presenta lo ione comune m/z 192 nello spettro MS/MS.
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Capitolo 1
La Spettrometria di Massa
Capitolo 1
La spettrometria di massa
1– Introduzione
La spettrometria di massa (MS) è una disciplina chimica microanalitica
che richiede generalmente solo poche nanomoli di campione, per ottenere
informazioni che riguardano la struttura e il peso molecolare
dell’analita.Essa viene definita distruttiva dal momento che il campione
analizzato viene distrutto durante l’analisi. In tutte le sue varie forme è
necessario che dell’energia venga trasferita alle molecole dell’analita in
modo da produrre la loro ionizzazione. In molti casi lo ione molecolare
dell’analita che si forma ”esplode” in una varietà di ioni frammento,
attraverso processi sia consecutivi che competitivi. Nei casi in cui lo ione
molecolare o “quasi molecolari” sia stabile, la frammentazione può essere
indotta per collisione; in ogni caso il risultante “pattern” di frammentazione
costituisce lo spettro di massa. Una molecole generica M può essere
ionizzata per rimozione o aggiunta di un elettrone, portando
rispettivamente alla formazione degli ioni M
.+
e M
+-
entrambi
corrispondenti al peso molecolare della molecola originale.
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Capitolo 1
La Spettrometria di Massa
2– Lo spettro di massa
In linea di principio lo spettro di massa, normale o collisionale, di ciascun
composto è unico e può essere utilizzato come “finger print” chimico per
caratterizzare il campione o per identificarlo in miscele molto complesse,
anche se presente a livello di tracce. Indipendentemente da come sono
creati e separati gli ioni in uno spettrometro di massa, lo spettro di massa
che si ottiene non è altro che un diagramma su cui in ascissa sono riportati i
valori m/z dei picchi relativi alle specie ioniche presenti ed in ordinata
l’intensità o abbondanza in unità arbitrarie. Il rapporto massa/carica (m/z) è
il rapporto tra la massa m dello ione, misurata rispetto alla massa del
12
C
che per convenienza è 12,000000, ed il numero z di cariche elettrostatiche
(misurate rispetto a quello dell’elettrone, cui viene assegnata una carica
elettrostatica negativa unitaria) presenti sullo stesso ione. Poiché la
stragrande maggioranza degli ioni prodotti in uno spettrometro di massa,
tranne nel caso dell’Electrospray, ha una sola unità di carica, il rapporto
m/z di uno ione viene frequentemente identificato con la massa dello ione.
In generale quando una molecola è ionizzata, per rimozione di un elettrone
si origina un radical-catione M
.+
detto ione molecolare il quale genera nello
spettro di massa un picco denominato picco ionico molecolare, che
compare a un valore m/z numericamente uguale al peso molecolare
nominale dell’analita. Questo ione molecolare può contenere sufficiente
energia interna dando delle frammentazioni successive che portano alla
formazione di specie neutre, cationiche o radicaliche.
M - e
-
M
+.
A
+
+N
.
M - e
-
M
+.
A
+.
+N
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Capitolo 1
La Spettrometria di Massa
Esso è inoltre, il primo precursore di tutti gli ioni frammento nello spettro
di massa.
Lo spettrometro di massa sarà perciò in grado di separare tutti i frammenti
carichi (A
+
e A
.+
), questi a loro volta possono contenere energia interna
sufficiente per generare successivi frammenti ionici anch’essi suscettibili
all’analisi spettrometrica.
M
.+
A
+
B
+
C
+
etc
N
.
Na
Nb
Questo schema mostra il percorso specifico di reazioni di
frammentazioni, cioè un pathway di frammentazione che la specie sotto
esame può seguire. Il pathway di frammentazione può essere alquanto
semplice, presentando così uno spettro altrettanto semplice, oppure può
essere compresso,cioè caratterizzato dalla coesistenza di più meccanismi di
frammentazione,competitivi e consecutivi, generando perciò uno spettro
più complesso. Tutto ciò è determinato dall’eccesso di energia interna data
allo ione molecolare (M
.+
), dalla struttura di questo ione e dal tempo che
intercorre tra la formazione dello ione e il detector.
Il picco ionico molecolare,nello spettro di massa, è assente o poco
intenso quando:
• Lo ione molecolare è caratterizzato da un processo di
frammentazione con energia di comparsa (AP) molto prossima al
potenziale di ionizzazione (IP), cioè quando tra i processi di
frammentazione dello ione molecolare,uno di essi è governato da
una energia di attivazione molto bassa;
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Capitolo 1
La Spettrometria di Massa
• L’analita subisce una decomposizione termica prima della
ionizzazione.
Quando non si realizzala prima condizione ed è assente la
decomposizione termica è possibile aumentare l’intensità del picco ionico
molecolare, nello spettro di massa, diminuendo l’energia di ionizzazione.
Una molecola può anche essere ionizzata per aggiunta di una specie carica,
che con la molecola originale porta alla formazione di ioni tipo [M+H
n
]
+
e
[M-H
n
]
-
con peso molecolare differente da quello della molecola
originaria, queste specie di cariche sono chiamate ioni quasi molecolari e
ioni molecolari protonati (o deprotonati).
Se una molecola perde ad esempio, nel processo di ionizzazione
elettronica due elettroni, si ottiene una ione molecolare doppiamente carico
che produce nello spettro di massa un picco ad un valore m/z
numericamente uguale alla metà del peso molecolare del composto.
Analogamente se una molecola acquista nH
+
durante il processo di
ionizzazione electrospray si ottiene uno ione molecolare protonato che
produce nello spettro di massa un picco ad un valore di m/z
numericamente uguale ad ¼ del peso molecolare del composto aumentato
di n unità (M+n/n). Questi sono detti ioni a carica multipla.
Il picco più intenso di uno spettro di massa è il picco base e viene
utilizzato come base unitaria rispetto alla quale normalizzare le
abbondanze relative di tutti gli altri ioni. Per definizione, quindi, l’intensità
relativa del picco base è 100% mentre le intensità degli altri picchi sono
espresse in % Relative Intensity (R. I.). Un modo alternativo per misurare
l’intensità relativa consiste nell’utilizzare la corrente ionica totale (TIC =
Total Ion Current) come base per normalizzare lo spettro di massa, dove la
TIC rappresenta la somma delle intensità di tutti i picchi presenti in un
definito intervallo di massa. In questo caso le intensità di tutti i picchi sono
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Capitolo 1
La Spettrometria di Massa
espresse in %Σn, dove n rappresenta il valore più piccolo m/z da cui è
calcolata la TIC.
La capacità dello spettrometro di massa di separare due picchi adiacenti è
detta risoluzione (R) ed è data dalla relazione:
R = M
n
/ (M
n
-M
m
)
dove M
n
è il valore di massa superiore i due picchi adiacenti e M
m
è il
valore di massa inferiore:
Oppure espressa in parti per milione (ppm):
R(ppm) = 10
6
*∆m / M
In spettrometria di massa ci sono tre livelli di risoluzione: bassa
risoluzione, media risoluzione ed altra risoluzione.
I valori di risoluzione indicati per poter essere significativi devono
essere accompagnati da una descrizione del grado di separazione dei due
picchi fornendo il valore della valle, espressa in % dell’altezza dei picchi,
corrispondente al grado di separazione. Le risoluzioni vengono
generalmente espresse al 5% o al 10% della valle; questo grado di
risoluzione viene detto “unit resolution”.
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Capitolo 1
La Spettrometria di Massa
Nei casi in cui la risoluzione dello spettrometro di massa è
sufficientemente elevato ad ogni picco si accompagna uno o più picchi ad
(m+1), (m+2), etc.
Ciò è dovuto alla presenza dell’analita di isotopi stabili degli elementi che
entrano nella composizione elementare dell’analita. L’intensità di questi
picchi isotopici segue la distribuzione isotopica naturale degli elementi :
ABBONDANZA ISOTOPICA NATURALE
X
Massa %
X+1
Massa %
X+2
Massa %
H
C
N
O
F
Si
P
S
Cl
Br
I
1 99,99
12 98,9
14 99,6
16 99,76
19 100
28 92,2
31 100
32 95,02
35 75,77
79 50,5
127 100
2 0,01
13 1,1
15 0,4
17 0,04
29 4,7
33 0,76
18 0,20
30 3,1
34 4,22
37 24,23
81 49,5
Si potrebbe continuare con i picchi isotopici (m+3), (m+4), etc, il cui
contributo,trascurabile per le molecole con pochi atomi di carbonio diventa
significativo per molecole ad alto peso molecolare le quali presentano
“cluster isotopici” complessi anche per il contributo aditivo degli isotopici
degli altri elementi.
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Capitolo 1
La Spettrometria di Massa
3- Lo spettrometro di massa
Gli elementi essenziali di uno spettrometro di massa di qualunque tipo
esso sia sono:
1)il sistema di introduzione del campione (inlet system) nello
spettrometro di massa;
2)la sorgente ionica (ion source).dove avviene la ionizzazione
dell’analita;
3)l’analizzatore di ioni (separation of ion oppure anlalyser): la zona
dello strumento adibita alla separazione degli ioni;
4) il rilevatore ioni (detection of ion);
5)il sistema dei acquisizione ed elaborazione dati (recording of ion
arrivals): la registrazione dello spettro
.
L’intero sistema è tenuto a pressione molto bassa (alto vuoto) rendendo
così l’introduzione del campione nella sorgente uno step piuttosto
complesso.
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Capitolo 1
La Spettrometria di Massa
3.1 Il sistema di introduzione
I modi d’introdurre il campione all’interno dello strumento sono vari,
normalmente dipendono dalla volatilità e dalla natura del campione, ed
anche dal metodo di ionizzazione utilizzato.
L’inlet system è un dispositivo pneumatico che serve ad introdurre il
campione nella sorgente ionica senza alterare le condizioni operative di
pressione che è dell’ordine di 10
-5
-10
-6
Torr.
I gas ed i composti volatili a temperatura ambiente, sono introdotti nella
sorgente attraverso un glass sinter e procedono fino alla sorgente in un tubo
di vetro alla pressione di 10
-6
Torr. Questo genere di sistema di
introduzione del campione è chiamato “ cold inlets”.
Funzionano allo stesso modo gli “ hot inlets”, il campione è però riscaldato
alla temperatura di 300°C, permettendo così la volatilizzazione di molti
composti. Tutto il sistema è un vetro, in quanto la presenza di un metallo
lavorando ad alte temperature, potrebbe catalizzare reazioni di
decomposizione dell’analita.
Un altro metodo alternativo è quello di utilizzare un “septum inlet”,
costituito da un serbatoio riscaldato in acciaio inossidabile, in cui il
campione è iniettato allo stato liquido via septum. Tenuto a bassa pressione
ed alta temperatura, il campione è vaporizzato e diffuso nella sorgente per
mezzo di un sistema di valvole. L’inconveniente è che però non tutti i
campioni possono essere vaporizzati ad alte temperature, perché sono
suscettibili a degradare, vengono perciò introdotti nello strumento mediante
un probe passando attraverso una zona tenuta sotto vuoto da poter originare
una vaporizzazione dell’analita in maniera soft. Questo genere di
immissione del campione è comunemente usato in combinazione con
tecniche di ionizzazione mild come FAB(Fast Atom Bombardment) e DI (
Desorption Ionizzation).
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Capitolo 1
La Spettrometria di Massa
Un altro sistema è quello di introduzione diretta, identificato come DIS
da “direct inlet system”.
Esso è costituito da un’asta metallica detta sonda o “probe” sulla cui
estremità vi è un alloggiamento per depositare il campione. Tale
alloggiamento è di varie forme in funzione del tipo di ionizzazione in uso;
può essere riscaldato fino a 400°C , o eventualmente raffreddato al di sotto
della temperatura ambiente. Tale sistema di introduzione viene impiegato
per campioni da analizzare direttamente senza alcuna preventiva
separazione analitica, cioè per campione generalmente puri.
Per miscele complesse si può ricorrere alla preventiva separazione
mediante gascromatografia (GC) o cromatografia liquida a alte prestazioni
( HPLC o LC); in questi casi il sistema d’introduzione è una vera
interfaccia tra le due strumentazioni la cui funzione è quella di rendere
compatibile l’abbinamento di sistema cromatografici, che funzionano sotto
pressione con lo spettrometro di massa, che funzione sotto vuoto spinto. La
gascromatografia viene utilizzata per miscele gassose, mentre nel caso di
soluzioni ci si avvale dell’uso di LC o HPLC.
Sono tipiche interfacce per collegamento GC – MS:
A) il separatore a getto (o di Rihaghe);
B) l’interfaccia open-split.
Ma nel GC-MS si può eliminare l’impiego dell’interfaccia quando si
utilizzano colonne capillari con diametri interni di qualche decimo di
millimetro. Infatti, queste colonne richiedono flussi di gas di trasporto
dell’ordine di 1-2 ml/min che sono compatibili con gli attuali sistemi di
pompaggio senza che il vuoto operativo nello spettrometro di massa sia
compromesso.
Mentre tipiche interfaccia per il collegamento HPLC-MS (oLC-MS) sono
la “particle beam”, la “thermospray” e la “ electrospray”. La termospray e
l’electrospray rappresentano però anche due specifici metodi di
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Capitolo 1
La Spettrometria di Massa
ionizzazione a pressione atmosferica (API = atmospheric pressare
ionizzation).
3.2 La sorgente ionica
La sorgente ionica rappresenta quella parte dell’apparecchiatura in cui
molecole gassose, liquide o solide vengono trasformate in ioni desolvatati
in fase gassose. Generalmente è una zona ben delimitata dove gli ioni,
appena formati, risiedono brevissimamente prima di essere spinti verso
l’analizzatore. Nella sorgente ionica avvengono anche quei processi di
frammentazione spontanei,consecutivi o competitivi, dello ione molecolare
o degli ioni frammento che portano alla formazione di un certo numero di
specie ioniche, a definiti valori di m/z, che costituiscono lo spettro di
massa. Gli ioni, quando si formano, vengono inviati all’analizzatore sotto
forma di un fascio ionico ben focalizzato, fanno parte perciò della sorgente
anche una serie di elettrodi che servono ad accelerare gli ioni ed a
focalizzare il fascio risultante. Quindi la sorgente ionica è costituita da:
• la camera di ionizzazione che rappresenta l’ambiente più o meno
chiuso all’interno del quale avviene il processo di ionizzazione vero
e proprio;
• gli elettrodi che generano i campi elettrici e servono ad accelerare e
dirigere gli ioni.
Generalmente, prima di entrare nell’analizzatore, il fascio ionico viene in
parte intercettato da un elettrodo che genera una corrente chiamata
“corrente ionica totale” o TIC (total ion current). Questa corrente è
proporzionale alla quantità di ioni raccolti,i quali sono a loro volta
proporzionali alla quantità di sostanze che si trova in quel momento nella
sorgente e soggetta al processo di ionizzazione. Nel caso di scansioni
continue, la TIC può essere anche generata dal sistema di acquisizione ed
elaborazione dati sommando le intensità di tutti i picchi registrati negli
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Capitolo 1
La Spettrometria di Massa
spettri di massa. Nel caso di analisi GC-MS ed HPLC-MS il profilo della
TIC è solitamente sovrapponibile al cromatogramma ottenuto con i
rilevatori cromatografici classici.
Esistono diversi tipi di sorgenti ioniche, queste vengono scelte in
funzione delle caratteristiche chimico-fisiche dell’analita e che perciò
sfruttano principi fisici diversi per generare ioni gassose da molecole
neutre.
La sorgente a ionizzazione elettronica (EI), detta anche ad impatto
elettronico, è il metodo più diffuso e per lo più viene usato per specie
volatili o bassobollenti.
Le molecole neutre vengono introdotte tramite un sistema di introduzione
e devono essere già in fase gassose per avvenire la ionizzazione. La
ionizzazione avviene per interazione con un fascio di elettroni ad alta
energia emessi per effetti termoelettrico da un filamento ed accelerati da
una trappola posta ad una differenza di potenziale di 70 eV; gli elettroni di
bombardamento acquistano così un’energia di 70 eV. Questo fascio di
elettroni di bombardamento si muove su un percorso a spirale per effetto
del campo magnetico locale generato da due piccoli magneti,aumentando
così la probabilità di interazione degli elettroni con le molecole neutre.
L’elettrone in movimento può essere considerato come un pacchetto di
17
Capitolo 1
La Spettrometria di Massa
energia presentando un movimento ondulatorio analogo a quello di un
fotone; durante l’approccio elettrone/molecola il campo elettrico dell’onda
e il campo magnetico della molecola si modificano mutuamente. In seguito
al processo di ionizzazione si innescano una serie di processi di
frammentazioni unimolecolare; questa interazione tra l’elettrone di
bombardamento e le molecole gassose M dell’analita può essere illustrata
come segue:M, la molecola generica, interagisce con uno elettrone, il quale
contiene una energia maggiore rispetto a quella di ionizzazione della
molecola stessa. L’impatto è tale da permettere all’elettrone di trasferire
alla specie neutra una quantità sufficiente di energia da poter eccitare la
molecola. E’ possibile che l’interazione possa portare alla formazione di
una specie eccitata, in cui il trasferimento di energia comporta il passaggio
di un elettrone da un orbitale interno ad uno esterno della molecola:
M+e
-
M* + e
-
M + e
-
M
+.
+2e
-
M+e
-
M
-.
L’energia degli elettroni di bombardamento è molto più grande
dell’energia di un normale legame chimico ed inoltre l’interazione
elettronica genera uno ione molecolare radicalico in uno stato fortemente
eccitato, per cui esso può, a volte, decomporsi prima di essere rivelato per
ciò viene considerato un metodo di ionizzazione hard.
La ionizzazione chimica (CI) è concettualmente simile a quella EI, ma,a
differenza di quest’ultima, la pressione nella camera di ionizzazione della
sorgente viene mantenuta a un valore compreso tra 0,1 Torr e 2,0 Torr per
introduzione di un gas reagente
5,6,7
che può essere metano, isobutano,
ammoniaca oppure idrogeno che portano rispettivamente alla formazione di
ioni secondari del tipo CH
5
+
,C
4
H
9
+
,NH
4
+
e H
3
+
.
18
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