Nuovi inibitori della Multidrug Resistance (MDR): sintesi di derivati amminoalchilici ad elevata flessibilità molecolare

Introduzione
meccanismo biologico a causa del quale si instaura la resistenza, sono state finora
individuate, in maniera più precisa,  tre forme di MDR così classificate: 
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1
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MDR classica (classical MDR)
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MDR non classica (non P-gp MDR) 
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3
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MDR atipica (atypical MDR o at-MDR, altered-topoisomerase) 
Le prime due forme sono caratterizzate da un trasporto carrier-mediato dei farmaci con
scarsa specificità di substrato che provoca una minor capacità di accumulo dei 
chemioterapici nelle cellule tumorali; la MDR classica si esplica tramite la P-glicoproteina 
(Pgp, P-170 o Pg-170), la MDR non-Pgp attraverso la multidrug-resistance-associated
protein (MRP o MRP1). Questi due tipi di MDR, inoltre, sono associati alla
sovraespressione del carrier di membrana nelle cellule neoplastiche dovuta o
all’aumentata amplificazione genica o all’attivazione trascrizionale. Il terzo tipo di MDR, la 
MDR atipica, è causata dalla mancata formazione del complesso ternario stabile DNA-
topoisomerasi II-farmaco, dovuta a alterazioni quali-quantitative dell’enzima topoisomerasi
IID ; quest’enzima ha infatti il ruolo di stabilizzare il complesso DNA-topoisomerasi nel 
processo di replicazione del DNA, evitando che ci siano superavvolgimenti positivi nel 
DNA eucariotico, causa di aggrovigliamenti. La MDR atipica si esplica solo con farmaci 
quali acridine, antracicline, antracendioni e epipodofillotossine, tutte sostanze che 
agiscono attraverso l’inibizione della topoisomerasi; la MDR non si ha invece con gli 
alcaloidi della Vinca, per esempio, perché questi sono agenti antimicrotubolari che non
interagiscono con l’enzima. Inoltre questo tipo di MDR non risulta essere associata a 
sovraespressione dei carrier di membrana (Pgp) e non mostra variazione di accumulo di
chemioterapici all’interno delle cellule tumorali >15@.
1.2 LA P-GLICOPROTEINA (Pgp)
Come già visto nel capitolo precedente, le forme di MDR più note sono dovute alla 
presenza di proteine trasportatrici capaci di ridurre attivamente la concentrazione di 
chemioterapico nelle cellule tumorali al di sotto del valore necessario per esplicare 
l’attività.
La maggior parte di queste pompe di efflusso appartiene alla superfamiglia di proteine 
transmembrana ATP-dipendenti, detta ATP-binding cassette (ABC). Attualmente sono
note più di 50 proteine appartenenti a questa famiglia. Di questa famiglia fanno parte altre 
proteine che agiscono attraverso lo stesso meccanismo di estrusione della Pgp; ad
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Introduzione
esempio la multidrug resistance associated protein (MRP) e la breast cancer resistance 
associated protein (BCRP)  chiamata anche mitoxantrone resistance protein (MXR) [16]. I 
geni che codificano per queste tre proteine sono rispettivamente ABCB1 (Pgp), ABCG2
(BCRP), ABCC1(MRP1); essi sono stati identificati in cellule tumorali e proprio per questo
motivo sono ampiamente studiati [17-18]. Il gene umano della Pgp è detto anche mdr-1.
Queste proteine sfuttano l’energia sviluppatasi dall’idrolisi dell’ATP per trasportare ed 
espellere all’esterno della cellula, attraverso vari tipi di membrane cellulari, una grande
varietà di molecole, da piccole molecole come cationi organici, aminoacidi, antibiotici, a 
macromolecole come proteine e polisaccaridi. Tuttavia, spesso, tra le sostanze verso cui 
si instaura la  MDR si possono evidenziare delle caratteristiche comuni quali: alta 
idrofobicità, alto peso molecolare, carica positiva a pH neutro, capacità di diffondere 
passivamente all’interno della cellula [19].
Figura 1.1: In figura è riportata una rappresentazione schematica di come la Pgp espelle al di 
fuori della cellula farmaci e xenobiotici
La più studiata  tra le  pompe d'efflusso  e quella coinvolta nella MDR classica  è la P-
glicoproteina (Pgp), una glicoproteina con un peso molecolare di circa 170 Kda, prodotta
nell'uomo dal gene mdr-1. Essa è stata chiamata P-glicoproteina, dove P sta per 
permeability >20@, in quanto fin dall’inizio risultò essere associata ad un’alterata
permeabilità della membrana ai farmaci. 
La Pgp sfrutta l’energia derivante dall’idrolisi dell’ATP per espellere fuori dalla cellula, 
contro gradiente, una grande varietà di sostanze citotossiche con struttura e dimensioni 
diverse. La Pgp è presente normalmente nelle cellule sane dove svolge molte funzioni 
fisiologiche; è invece sovraespressa all’interno di cellule tumorali di individui con 
un’aumentata resistenza alla cura chemioterapica. 
Dal punto di vista clinico la Pgp è importante perché è strettamente legata al fenomeno 
della MDR nella terapia antiAIDS e antitumorale perché è in grado di conferire resistenza 
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Introduzione
tramite il riconoscimento, il legame e l’espulsione dall’interno delle cellule di un’ampia
varietà di sostanze idrofobiche e amfipatiche, tra cui sono compresi anche una grande 
varietà di farmaci anticancro e di inibitori dell’HIV proteasi >21@.
I substrati tradizionali della Pgp comprendono, tra gli agenti citotossici, le antracicline, 
gli alcaloidi della Vinca, i taxani e le epipodofilotossine e tra i più recenti farmaci
antitumorali, l’Imatinib [22], la ecteinascidina [23] ed il gemtuzumab [24].
Le antracicline (es. doxorubicina, epirubicina e daunorubicina) sono alcuni tra gli agenti 
tumorali maggiormente utilizzati nel trattamento dei tumori solidi e di quelli ematologici
[25].
La doxorubicina e la epirubicina sono attive nei carcinomi della mammella, dell’ovaio,
della cervice uterina e dell’endometrio così come nei sarcomi e nei linfomi [26-27]; la 
daunorubicina mostra invece attività nella leucemia linfoblastica acuta e in quella 
mieloblastica acuta [27]. I taxani (paclitaxel, docetaxel) sono caratterizzati da un ampio 
spettro di attività nei confronti dei tumori solidi umani (ad es. carcinomi della mammella, 
dell’ovaio, del polmone, della testa-collo, della vescica e dell’esofago) [28]. 
Non sorprende quindi che l’aumentata espressione del gene mdr-1 in campioni 
tumorali di pazienti non chemiotrattati affetti da tumore intrinsecamente resistente ai 
suddetti farmaci, ed in campioni tumorali di pazienti che sono divenuti resistenti dopo
trattamento chemioterapico, dimostri che la MDR mediata dalla Pgp gioca un ruolo clinico 
importante in molti tumori umani, soprattutto nel tumore della mammella e nella leucemia 
mieloide acuta [28] ed è per questo che la sovraespressione di questa glicoproteina nelle
cellule tumorali rappresenta un bersaglio terapeutico importante al fine del superamento 
della resistenza [29]. 
1.2.a Struttura della Pgp 
La Pgp è una proteina la cui struttura primaria è costituita da un unico polipeptide di 
1280 aminoacidi, disposti in 2 unità ripetute, ognuna di 610 aminoacidi, collegate da un 
segmento di 60 aminoacidi (linker region) >30@. Questa proteina è N-glicosilata sul lato 
extracellulare.
Studi biochimici dimostrano che le due metà di cui è costituita sono strutturalmente 
omologhe ed ognuna comprende un dominio transmembrana (TMD), che sembra 
rappresentare il principale sito di interazione con i farmaci, dei segmenti N-terminali 
idrofili, un dominio di legame con l’ATP (NBD= nucleotide-binding domain o ABS=ATP-
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Introduzione
binding site) e tre domini intracellulari  idrofili C-terminali (ICD) che collegano i TMD agli 
NBD >16@: due estese regioni (ICD1) e (ICD2) e un sottodominio intracellulare (ICD3). 
I dati di idrofobicità indicano che ogni TMD è costituito da 6 D-eliche, dato che è stato 
confermato dal confronto con le strutture di due trasportatori ABC batterici e da studi
condotti sulla MsbA, proteina batterica omologa alla Pgp estratta da Escherichia Coli, in 
cui però è differente l’organizzazione delle D-eliche nella membrana >31@. Il modello 
topologico più diffusamente accettato rappresenta quindi la Pgp come costituita da due 
metà, ognuna delle quali comprende un dominio idrofobico NH
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terminale con 6 sequenze
transmembrana costituite da D-eliche, separate tra loro da loop idrofili. Al dominio
idrofobico segue il dominio idrofilo che contiene il sito di legame del nucleotide; 
quest’ultimo si trova sul lato citoplasmatico della membrana e accoppia l’idrolisi dell’ATP
con il processo di trasporto.
NBD2
NBD1
in
out
COOH
NH
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1
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5
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6
*
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12
*
11
*
10
*
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Figura 1.2: Modello schematico della P-glicoproteina e dei suoi domini funzionali. I domini
direttamente coinvolti nel legame sono contrassegnati con l’asterisco.
La Pgp è una proteina di trasporto ATP-dipendente un po’ particolare in quanto
presenta attività ATPasica basale anche in assenza di substrato [32] che però aumenta in 
presenza del farmaco [33]. Tramite studi di binding si è dimostrato che l’ATP non è
necessario per il legame del farmaco con la glicoproteina, ovvero il riconoscimento del 
substrato e il legame con l’ATP sono due meccanismi indipendenti l’uno dall’altro. Il
legame e la successiva idrolisi dell’ATP sono invece essenziali per il trasporto del 
farmaco. Inoltre entrambi i siti di legame con il nucleotide sono necessari per la funzione,
perché la Pgp è inattiva quando l’idrolisi dell’ATP è bloccata, in ciascuno dei siti 
singolarmente, tramite mutazione o modificazione chimica >34@.
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Introduzione
Il progresso nella comprensione del meccanismo di trasporto del farmaco è ancora 
ostacolato dall’insufficienza di informazioni dettagliate circa la struttura 3D della Pgp.
Comunque sono stati fatti importanti progressi recentemente a questo scopo. Studi di 
mutagenesi, fotoaffinità, di labeling e di cross-linking, hanno permesso di identificare i 
residui coinvolti nel sito di legame con il farmaco che si trovano nei siti TMD.  Da questi 
studi sembra che  i segmenti transmembrana 4, 5 e 6, situati nel primo dominio idrofobico,
e 10, 11 e 12, situati nel secondo, siano direttamente coinvolti nel trasporto dei farmaci 
>35@. In questi studi sono stati usati una serie di cross-linkers specifici per tioli con un 
“braccio spaziatore” di varie lunghezze (da 2 a 17 atomi) per misurare la distanza fra
questi residui (figura1.3).
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5
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1
Lato extracellulare 
9-25A
50A
NBF1 NBF2
Lato intracellulare 
TMD2TMD1
LipidiLipidi
Figura 1.3: A sinistra è riportata la struttura della Pgp vista in sezione, a destra la struttura 
della Pgp vista dal lato citoplasmatico dove i cilindri numerati rappresentano i domini TMD e l’area
evidenziata rappresenta il sito di legame per il farmaco. Figura che origina dagli studi [35] 
In questo modello il dominio di legame con il farmaco appare come un imbuto, con il
punto più largo rivolto verso il lato extracellulare e quello più stretto verso il lato
citoplasmatico. Il legame con il farmaco dovrebbe avvenire vicino al centro del poro [34].
Inoltre i segmenti TMD coinvolti nel legame con il farmaco sono più vicini reciprocamente 
rispetto ad altri TMD sul lato citoplasmatico della membrana. I segmenti TMD ed il sito di
legame con l’ATP sembrano essere conformazionalmente flessibili da essere in grado di 
accogliere substrati strutturalmente diversi [21]. 
La microscopia elettronica e l’analisi a singola particella hanno confermato, con
risoluzione di 1 nm, una struttura nella quale i due TMD formano un canale centrale che è 
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Introduzione
accessibile dalla fase acquosa extracellulare come anche dall’interno della membrana 
lipidica.
E’ stata inoltre ipotizzata una struttura 3D della Pgp tramite molecular modeling,
usando come riferimento la struttura di una proteina batterica omologa, la MsbA. Tale
proteina, ottenuta da E. Coli, funziona come un trasportatore di lipidi e presenta una 
notevole omologia, sia nella sequenza che nella funzione, con la Pgp. Dallo studio della 
struttura cristallina della MsbA, è stato ottenuto un modello (homology modelling) che ha
fornito informazioni dettagliate sulle interazioni fra il dominio transmembranale ed il 
dominio di legame con il nucleotide. Tale modello rivela però differenze della Pgp, rispetto 
alla MsbA, che riguardano soprattutto la misura e la carica del canale interno, e possono 
essere relative alla diversa specificità di substrato di MsbA rispetto alla Pgp [35]. E’ stata 
misurata la distanza tra TM6 e TM12 di MsbA e il confronto con i dati riportati in letteratura 
relativi alla Pgp sembra confermare l’ipotesi che la Pgp possa esistere in due forme 
differenti, una struttura aperta, simile alla struttura cristallina della MsbA, ed una struttura 
chiusa, evidenziata tramite EM (microscopia elettronica) della struttura cristallina
bidimensionale [35]. 
A = Conformazione aperta
B = Conformazione chiusa
Figura 1.4: Modello di Pgp basato sulla struttura cristallina di una proteina omologa: MsbA
transporter.
Infine Rosenberg e coll., hanno ottenuto una struttura 3D della Pgp, mediante 
cristallografia elettronica ottenuta prima con un limite di risoluzione di circa 2 nm in
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