Trapianto di cellule staminali mesenchimali nel midollo spinale in un modello sperimentale di sclerosi laterale amiotrofica

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fertilizzanti utilizzati per il mantenimento del prato del campo di calcio. 
Sfortunatamente, al momento nessuna di queste associazioni può essere provata. (Al-
Chalabi et al, 2005) 
9 L’incidenza della SLA è di circa 1-3 casi per 100000 l’anno e la sua prevalenza 
si aggira sui 3-5 casi per 100000 l’anno (rapporto maschi/femmine 1.5/1), 
rappresentando così la causa più frequente di paralisi nell’adulto. Benché la SLA possa 
colpire individui di ogni età, generalmente è prediletta l’età adulta avanzata con picco 
fra i 50-70 anni. 
9 Dal punto di vista anatomopatologico, la SLA è caratterizzata dalla perdita 
selettiva dei motoneuroni della corteccia cerebrale e dei motoneuroni delle corna 
anteriori del midollo spinale. I motoneuroni superstiti sono generalmente atrofici, e 
spesso presentano anomali accumuli di neurofilamenti (Corpi di Lewy), sia a livello del 
corpo cellulare sia a livello dell’assone. Queste alterazioni neuronali sono associate 
all’astrogliosi reattiva, che accompagna qualsiasi alterazione degenerativa del sistema 
nervoso interessando le fibre dei fasci piramidali  che decorrono nelle colonne laterali 
del midollo. 
9 Le più comuni manifestazioni cliniche dalla SLA includono debolezza 
muscolare, fascicolazioni, crampi e progressiva atrofia muscolare. La lesione del 
motoneurone periferico causa paresi e atrofia muscolare: questa è assai spiccata ai 
muscoli delle  mani con quadro, a malattia conclamata, di mano ad artiglio. I muscoli 
degli arti inferiori e quelli prossimali dei superiori sono di solito meno gravemente 
interessati, ma mai indenni. La lesione dei motoneuroni dei nervi cranici produce 
disturbi trofici e paretici dei muscoli della faccia, della lingua, della faringe e della 
laringe causando gravi disturbi di deglutizione e di masticazione, e disartria.                        
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La lesione del motoneurone centrale, oltre a concorrere a provocare i fenomeni paretici, 
si manifesta con accentuazione dei riflessi propriocettivi (risposte policinetiche, 
estensione delle aree reflessogene, fenomeno di Babinski, cloni delle rotule e dei piedi, 
riduzione dei riflessi esterocettivi addominali) e con spasticità. 
9 La SLA ha un decorso progressivamente ingravescente e di solito porta a morte 
in 2-3 anni per complicazioni varie; frequenti sono la polmonite ab ingestis dovuta alla 
disfagia e l’insufficienza respiratoria causate dal progressivo declino della funzione 
muscolare. Non sono eccezionali i casi con sopravvivenza più lunga (almeno un caso su 
cinque).  
Non esistono delle efficaci strategie terapeutiche, l’unica eccezione, sulla base 
dell’ipotesi eccitotossica, è al momento rappresentata dal Riluzolo (inibitore della 
liberazione pre-sinaptica del glutammato) (Gurney ME et al, 1996). I recenti trials 
clinici con l’uso di questo farmaco sono stati piuttosto deludenti, hanno dimostrato solo 
un modesto aumento della sopravvivenza, di circa 3 mesi, e una scarsa efficacia nel 
combattere la progressione della malattia.  (Miller  RG et al, 2002). 
Dal punto di vista epidemiologico si possono distinguere due forme di SLA. 
Comunemente la SLA è di tipo sporadico (SALS), solo nel 10% dei casi la SLA è 
ereditaria (o familiare: FALS). Non vi sono differenze cliniche apprezzabili tra SALS e 
FALS ad eccezione dell’età di esordio: nei casi di SALS è intorno ai 60 anni, nei casi di 
FALS è intorno ai 40 anni. La SLA di tipo sporadico inoltre colpisce maggiormente gli 
uomini rispetto alle donne, e in questi l’esordio sembra essere più precoce e la malattia 
più severa. Le cause di SLA sono tutt’oggi sconosciute. Solo nel 10% dei casi di SLA 
familiare, è stato identificato come causa un difetto genetico sul cromosoma 21, in 
particolare sul gene della Cu/Zn superossido-dismutasi (SOD1), enzima citoplasmatico 
 8
antiperossidante (Rosen DR et al, 1993). Tale enzima ha il compito di rimuovere i 
radicali liberi dalle cellule. In particolare SOD1 catalizza la reazione di detossificazione 
dell’anione soperossido (O
2
-
) che viene convertito in perossido di idrogeno (H
2
O
2
). Si 
conoscono 114 mutazioni sul gene SOD1 che causano la malattia, la maggior parte con 
ereditarietà di tipo dominante. La mutazione più frequente è D90A, la più studiata è 
G93A.       
                      
                                 
 
 
Fig. 1:Struttura cristallina del legame dimerico di SOD1 umano. Gli ioni di rame e zinco sono mosttrati 
rispettivamente come sfere blu e arancione. Il loop di zinco è colorato in arancione. il loop elettrostatico 
in verde. (Valentine S. et al, 2005) 
 
Tramite una moderna analisi di linkage, di recente, sono state identificate nuove 
mutazioni correlate alla malattia, ad esempio sul gene ALS2, che si trova sul 
cromosoma 2 e codifica per una proteina di 184 kD chiamata alsina ( Bruijn et al, 
2004). 
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Patologia               Ereditarietà                Linkage             Gene                  Esordio  
                  
SALS                                   no                         nessuno                sconosciuti               Adulto                       
 
FALS                                Dominante              21q22.1                     SOD1                  Adulto                     
                                                                                                                
ALS                                  Dominante                  16                               ?                     Adulto 
   
ALS                                  Dominante                  18                               ?                     Adulto 
    
ALS                                  Dominante                  20                               ?                     Adulto 
  
ALS con                           Dominante              9q21-22                                                 Adulto 
Demenza  
frontotemporale 
 
ALS con demenza,            Dominante               17q21                         Tau                   Adulto 
Parkinsonismo 
 
ALS giovanile  tipo 1       legata a X                Xp11- Xq12                  ?                    Adulto 
                                          Recessiva                 15q15-22                      ?               Adolescenza 
 
ALS giovanile tipo 3         Recessiva                    2q33                       ALS2          Adolescenza 
 
ALS giovanile                   Dominante                    9q34                          ?               Prima dei  
                                                                                                                                     25 anni 
Tab.1. Forme di SLA ereditarie. 
 
Fra tutte le mutazioni quella indagata con maggior attenzione è la forma legata al 
cromosoma 21. Infatti la ricerca genetica, grazie all’utilizzo di modelli murini, ripone in 
essa le speranze per comprendere il meccanismo fisiopatologico della malattia e per 
identificare nuovi approcci terapeutici (Cleveland DW, 1999). 
 
1.1.1  Modello  murino 
Esistono diverse linee di topi transgenici per SOD1 (Wong PC et al, 1995; Bruijn LI et 
al, 1997; Ripps ME 1995; Dal Canto et al, 1995; Kikugawa K et al, 1997), topi in cui 
sono state inserite più copie di questo gene. Questi animali presentano una patologia 
neurodegenerativa trasmessa con ereditarietà autosomica dominante sorprendentemente 
simile alla SLA; i sintomi iniziali sono solitamente una debolezza delle zampe 
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posteriori accompagnata da un fine tremore, seguita a breve distanza dai sintomi 
maggiori: una ingravescente perdita di funzione della muscolatura delle estremità che si 
tramuta in paralisi e atrofia muscolare da denervazione. Gli animali mostrano anche 
difficoltà ad alimentarsi e muoiono entro alcune settimane dall’esordio dei sintomi.  I 
topi portatori di un elevato numero di copie del transgene (high expressor) manifestano 
una patologia ad insorgenza precoce e rapidamente progressiva, mentre i topi con un 
minor numero di copie del transgene (low expressor) sono affetti da una patologia ad 
insorgenza tardiva e a lenta progressione. 
Il modello murino più utilizzato è quello proposto da Dal Canto e Gurney nel 1995. 
Essi produssero una linea di topi transgenici che sovraesprimevano una forma mutata di 
SOD, originariamente riscontrata in una famiglia affetta da SLA. Tale mutazione, 
situata nel quarto esone del gene della SOD, consisteva nella sostituzione della glicina 
in posizione 93 con un’alanina (G93A); furono ottenute diverse linee di topi 
transgenici, delle quali venne sviluppata in particolare quella denominata G1. 
All’interno di tale linea sono stati isolati due sottotipi: G1L, un low expressor (18 copie 
del gene) in cui la malattia esordisce in media al giorno P130; e un high expressor (25 
copie) che manifesta i sintomi più precocemente, intorno al giorno P90. Dal punto di 
vista anatomopatologico, le lesioni interessano la materia grigia delle corna anteriori 
del midollo spinale e dei nuclei motori bulbari, in modo sovrapponibile a quanto accade 
nell’uomo. Nei topi high expressor, le lesioni sono più estese e possono interessare le 
corna posteriori, il nucleo dorsale del vago, la formazione reticolare, il nucleo rosso, la 
sostanza grigia, la materia grigia del talamo e del cervelletto.             
Microscopicamente, l’alterazione più precoce consiste nella presenza di vacuoli di 
diverse dimensioni che compaiono a partire dalla seconda settimana di vita, e sono 
 11
rilevabili con la microscopia elettronica (Bendotti C. et al, 2001; Mourelatos Z et al, 
1996). Appena prima dell’insorgenza dei sintomi, negli animali high expressor 
compaiono dei vacuoli citoplasmatici originati dalla dilatazione dei mitocondri  e del 
reticolo endoplasmatico; nei low expressor, come nei casi familiari di SLA, tali vacuoli 
sono raramente osservabili (Sasaki S et al, 1998). Nella fase di malattia conclamata, i 
motoneuroni delle corna anteriori  del midollo appaiono atrofici e ridotti di numero; 
sono presenti inclusioni citoplasmatiche ialine ubiquitinate (NHI, neuronal hyalin 
inclusions), positive all’immunoistochimica per gli anticorpi anti-SOD1, localizzate nel 
corpo cellulare e negli assoni, che appaiono rigonfi. Istologicamente le NHI consistono 
di un core eosinofilo circondato da un alone pallido, e gli studi ultrastrutturali mostrano  
la presenza in esse di neurofilamenti associati a fibrille di maggior spessore; esse 
appaiono dunque molto simili  ai corpi di Lewy presenti in diverse patologie 
neurodegenerative (Shibata N et al, 1998). I topi low expressor presentano tali 
inclusioni anche a livello astrocitario (AHI, astrocytic hyaline inclusions): esse sono 
positive all’immunoistochimica per SOD1, ubiquitina e GFAP (proteina gliale fibrillare 
acida) (Kato S et al, 1997). Le alterazioni compaiono nei low expressor all’incirca dopo 
quattro mesi e diventano via via più evidenti col progredire della malattia, interessando 
in particolare le colonne laterali e anteriori del midollo. 
In relazione al quadro anatomopatologico, gli animali low expressor appaiono dei 
modelli più precisi della forma familiare di SLA, e pertanto sono da considerarsi i più 
adatti per ottenere informazioni sulla patogenesi del danno neuronale e per 
sperimentare possibili strategie terapeutiche. 
 12
1.1.2 Meccanismi molecolari della perdita selettiva dei motoneuroni 
Il danno neuronale nei topi SOD1 presenta una patogenesi complessa, nella quale è 
difficile individuare la causa scatenante che dà origine alla cascata di eventi che 
culminano con la degenerazione selettiva dei motoneuroni. 
  
ALTERAZIONI MITOCONDRIALI, VACUOLIZZAZIONE E STRESS OSSIDATIVO 
Le lesioni iniziali sono localizzate nei mitocondri. Consistono in un variabile grado di 
disorganizzazione delle creste e dal rigonfiamento delle camere mitocondriali. Questo 
stadio precoce è caratterizzato anche dalla presenza di vacuoli di diverse dimensioni, 
con una singola membrana priva di ribosomi e con un contenuto chiaro. La loro origine 
non è definita. Oggi, si ritiene che la membrana di questi vacuoli origini dalla 
membrana esterna dei mitocondri o dal reticolo endoplasmatico.                                        
I mitocondri alterati e i vacuoli sono stati per lo più osservati nei dendriti di diverso 
calibro, nei corpi cellulari e in alcuni assoni dei neuroni delle corna anteriori (Bendotti 
C et al, 2001).  
I mitocondri potrebbero essere i primi siti danneggiati nei topi SOD1, perché la SOD1 
presentando un’alterata capacità metal-binding fa sì che gli ioni rame si accumulino 
nello spazio intermembrana (Okado-Matsumoto et al, 2002), oppure catalizzando 
reazioni e/o improprie aggregazioni fa sì che si generino molecole reattive (es. 
perossinitriti) che danneggiano questi organelli.  
Alternativamente le alterazioni mitocondriali potrebbero essere il risultato di 
cambiamenti nella permeabilità mitocondriale, risultanti da uno scorretto 
funzionamento del MPTP (mitochondrial permeability transition pore: un canale 
voltaggio dipendente permeabile ai cationi). Il malfunzionamento di questo canale può 
essere indotto da un eccessivo aumento intracellulare di calcio, di agenti ossidanti come 
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ROS (reactive oxygen species) (Carrì MT et al, 1997; Liu D. et al, 1999) e di 
glutammato. 
  
ANORMALITA’ CITOSCHELETRICHE E AGGREGAZIONE PROTEICA 
I neurofilamenti (filamenti intermedi del citoscheletro dei neuroni) sono proteine 
composte da tre monomeri: la subunità leggera (NFL), la subunità media (NFM) e 
quella pesante (NFH). Nei topi SOD1 i neurofilamenti si accumulano in forma 
iperfosforilata nel citoplasma del corpo cellulare e nei segmenti dilatati dell’assone.  
Questo accumulo può essere originato dall’alterata fosforilazione proteica prodotta 
dalle chinasi. Nel midollo spinale dei topi SOD, infatti, è stato rilevato un progressivo 
accumulo di p38MAPK (un componente della famiglia MAPK, una famiglia di serin-
treonin chinasi), che procede parallelamente alla degenerazione dei motoneuroni.  
p38MAPK attivato o da un aumento del livello di glutammato extracellulare o dalla 
presenza di citochine proinfiammatorie si colocalizza con i neurofilamenti fosforilati 
nei corpi cellulari e negli assoni prossimali dei motoneuroni e ne induce 
l’iperfosforilazione (Tortarolo et al, 2003). Quando diventano iperfosforilati, il loro 
trasporto può non essere funzionale, e ciò porta al loro accumulo (Shibata N et al, 
2001).