Nuovo metodo di analisi dei dati di assorbimento dei raggi x per l'indagine strutturale delle metallo proteine

INTRODUZIONE                                                                                                                        
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Questa costante di stabilità (K) riflette la forza dell’interazione elettrostatica fra i 
due componenti. Il metallo però coordina in genere più di un legante: 
 
 
 
 
 
 
Questa situazione si ritrova anche nel sito attivo di una macromolecola, in quanto 
la coordinazione è affidata a più di un residuo aminoacidico e quindi si forma una 
serie d’interazioni fra il metallo e gli atomi dei residui della proteina. 
1.1 LE METALLO-PROTEINE A RAME 
Queste proteine svolgono ruoli di trasferimento elettronico, di idrossilazione di 
vari substrati, di trasporto di ossigeno. Si tratta di un insieme piuttosto ampio i cui 
tipi principali sono: 
I. (type I) Un singolo atomo di Rame coordinato in forma tetraedrica, 
caratterizza il primo tipo. La coordinazione è data da due residui 
istidinici e 1 o 2 gruppi a zolfo (cisterna o metionina). Fra le proteine 
del gruppo abbiamo l’azzurrina e le proteine blu ( λ
max 
= 600 nm;), 
dalla funzione di trasferimento elettronico (Olsson, 1999). Un 
esempio delle reazioni di trasferimento catalizzate dall’azzurrina nel 
batterio Pseudomonas aeruginosa: 
 
azzurina)(Cu   c551) citocromo( Fe   azzurrina)(Cu c551) citocromo(Fe
:generaleReazione
223         
 ο 
 
 
II. (type II) In questo gruppo il Rame è coordinato in forma tetragonale-
piana. I sottogruppi in cui si suddivide, sono distinti non solo in base 
ai diversi gruppi di coordianazione ma anche dall’intorno. Il ruolo di 
queste macromolecole è quello di trasportatori elettronici o acidi di 
Lewis. Esempi sono la superossido dismutasi (Cu-Zn) e la nitrito 
ossidasi. 
ML + L ML
2
ML
2
 + L ML
3
ML
n-1
 + L ML
n
 
]L][ML[
][ML
K
.........   ;
ML][L][
]ML[
K    ;
[M][L]
[ML]
K
2
n
n
2
  21
  
    
                                                                                                                     INTRODUZIONE 
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III. (type III) Il sito è binucleare a Rame. In funzione  dell’intorno, vi è la 
modulazione dell’attività enzimatica. In questa categoria rientrano: 
tirosinasi, catecolo ossidasi, emocianine. I ruoli sono di ossidazione 
dei fenoli nelle prime e di trasporto di ossigeno nelle emocianine. 
Questa tesi ha come oggetto una proteina di questo gruppo, la 
tirosinasi. 
IV. (type 4) Sono  definite ossidasi multirame: contengono uno o più siti 
del tipo I, II, III. Quindi posseggono combinazioni delle 
caratteristiche  precedenti. Fra queste l’ascorbato ossidasi. 
La distribuzione nei vari taxa di queste proteine, è ubiquitaria: per esempio, la 
catecolo ossidasi è stata studiata nelle piante (Eicken,1998), l’emocianina invece, 
negli invertebrati (molluschi e artropodi) (Salvato, 1990; Markl, 1992; van Holde 
1995), la tirosinasi, coinvolta in formazione di pigmenti e altri composti 
polifenolici, anch’essa è distribuita in più taxa (Riley, 1997; Gillespie, 1997, 
Söderhäll 1998). 
 
1.1.1 Confronti strutturali proteine gruppo III 
 
Le proteine di questa classe presentano differenze dal punto di vista della 
sequenza aminoacidica e della struttura tridimensionale visibili anche a livello 
della struttura quaternaria (Decker, 2000;) ma presentano elevate somiglianze dal 
punto di vista delle proprietà spettroscopiche del sito attivo. 
Le zone più conservate della sequenza sono quelle deputate alla coordinazione 
degli ioni Rame (Lerch, 1988). Fra le emocianine di artropodi si ha una similarità 
di sequenza del 30-35%; tra le emocianine di molluschi del 30. Però confrontando 
le emocianine di artropode con quelle di mollusco, si trova che la similarità di 
sequenza risulta meno del 30%. 
Interessante è notare che fra emocianine e fenolo ossidasi di artropode, vi è un 
identità di sequenza maggiore del 30%, mentre fra le tirosinasi e catecolo ossidasi 
di funghi, molluschi, artropodi, l’identità di sequenza è meno del 10%. 
Dal punto di vista strutturale, l’emocianina di artropode possiede una struttura 
quaternaria formata da un esamero di catene polipeptidiche (ogni catena ha un 
peso di 75kDa e ognuna possiede un sito per il trasporto di ossigeno) o un 
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multiplo di esamero. Ogni esamero è organizzato in tre domini che possiedono tre 
motivi strutturali, ciascuno ripiegato in modo diverso. Il sito di legame 
dell’ossigeno è nel motivo centrale. 
Nei molluschi l’emocianina è formata da subunità decameriche (1 o 2) assemblate 
a cilindro cavo. Ogni subunità pesa 340-450 kDa, e contiene 7-8 unità funzionali, 
del peso di 50 kDa (Cuff, 1998). Ogni unità funzionale, (in cui si possono 
identificare 2 domini) può legare l’ossigeno molecolare tramite il sito binucleare a 
rame. La differenza da quella di artropode è che l’emocianina di mollusco non 
possiede il dominio N-terminale (Salvato, 1990; Miller 1998). La tirosinasi e la 
catecolo ossidasi si ritrovano in forma di monomero (~40 kDa per la tirosinasi e 
~75 per le catecolo), dimero e tetramero (Van Gelder, 1997). L’ assenza del 
frammento N- o C-terminale determina la differenza di peso molecolare. 
 
      
Figura 1.1-1: struttura cristallografica 
dell’emocianina di artropode Limuls 
polyphemus: in rosso α-eliche, in rosa eliche 3-
10, in blu scuro, ß-foglietti; in azzuro, turn; in 
arancione, coil (Hazes, 1996). Immagine 
ottenuta (come le successive) con il 
programma VMD 1.7.1 e POV ray 3.5. Codice 
PDB 1LL1. 
 
Dalle figure si può notare la presenza di un dominio centrale in α-eliche, in cui si 
trovano i residui aminoacidici di coordinazione degli ioni rame. Si analizzeranno 
le principali caratteristiche del sito più avanti. Un'altra caratteristica interessante è 
Figura 1.1-2: struttura cristallografica 
dell’emocianina del mollusco Octopus 
dopfleini. Si mantiene la stessa legenda 
di colori della figura 1.1-2 (Cuff , 1998). 
Cod. PDB 1JS8. 
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la differenza nella quantità di residui appartenenti a foglietti β in rapporto alla 
struttura totale, nelle varie proteine. Nelle strutture delle emocianine qui 
evidenziate si nota una maggior presenza di questo elemento topologico, rispetto 
alla catecolo ossidasi. 
        
Figura 1.1-3: struttura cristallografica della 
catecolo ossidasi del vegetale Ipomea batatas. 
Stessa legenda di colori delle figure precedenti 
(Klabunde et al.,1998). Cod. PDB 1BT3. 
 
 
 
1.1.1.1 I siti attivi delle proteine del gruppo III 
 
L’aspetto comune alle proteine del gruppo III, è che la coordinazione degli ioni 
Rame è data, da parte della matrice proteica, da residui di istidine (tre per ogni 
ione metallico). I residui del sito attivo aminoacidici sono piuttosto conservati. 
Nelle emocianine il sito B è altamente conservato (Van Holde, 1995): due istidine 
sono su un α-elica, la terza è su un'altra. Se nelle emocianine di artropode il sito A 
(il suo intorno) è simile al B, nei molluschi il sito A ha un’istidina su un loop 
consecutivo ad un’alfa elica, mentre le rimanenti sono su due α-eliche distinte. 
L’istidina del loop forma un ponte tioestere con una cisteina: questo ponte 
particolare sembra conservato nelle emocianine di mollusco e nella catecolo 
ossidasi (Klabunde, 1998). 
L’alta omologia strutturale fra il sito attivo delle strutture presentate nel paragrafo 
precedente (le tre emocianine e la catecolo ossidasi), si può notare dalla 
sovrapposizione presentata delle strutture dei siti attivi (figura 1.1.5). 
Figura 1.1-4: struttura cristallografica della
emocianina del mollusco Panolirus 
interruptus. Si mantiene lo stesso codice 
colore (Volbeda et ,1989). Cod. PDB 1NOL.
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Figura 1.1-5: Sovrapposizione dei siti attivi delle proteine del gruppo III con il programma 
VMD 1.7.1. Codice colore: arancione=Cu A,B); rosso=emocianina di O. dofleini; verde 
=catecolo ossidasi di I. batatas; azzurro chiaro= emocianina di P. interruptus; blu= 
emocianina di L. polyphemus. 
 
1.1.2 La proteina oggetto di questa tesi: la tirosinasi 
 
La tirosinasi è un ossidasi che svolge la propria azione nelle vie metaboliche che 
sono deputate alla sintesi di pigmenti e composti polifenolici in genere (Van 
Gelder, 1997). E' diffusa in batteri, piante, animali, funghi. La sua caratteristica 
principale è la capacità di catalizzare due diverse modalità di ossidazione. Infatti 
agisce nella idrossilazione di monofenoli a orto-difenoli (definita come attività 
cresolasica, identificata internazionalmente come E.C. 1.14.18.1
1
),inoltre la 
tirosinasi può catalizzare la successiva ossidazione da orto-difenoli a orto-chinoni 
(attività catecolo ossidasica, E.C. 1.10.3.1). Nelle piante la tirosinasi assume 
spesso il ruolo ossidasico.  
L'attività enzimatica è utilizzata per la sintesi di composti che assumono il ruolo 
di protezione in organismi vegetali e fungini: questo si attribuisce al prodotto di 
reazione, la melanina, che depositata in strati protegge da agenti patogeni.  
                                                 
1
Codice del “Nomenclature Committee of the International Union of Biochemistry and Molecular 
Biology (NC-IUBMB)”, (sez. Ossidoriduttasi) (http://www.chem.qmul.ac.uk/iubmb/enzyme/EC1/). 
                                                                                                                     INTRODUZIONE 
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Inoltre, anche l'imbrunimento enzimatico di molte piante e frutti è causato da 
questo enzima, che entra in azione in caso di danno meccanico delle cellule e dei 
tessuti.  
La sclerotizzazione dell’esoscheletro e la protezione dai patogeni presenti 
nell’ambiente, inglobati dalla melanina in caso di attacco, sono il risultato della 
azione enzimatica della tirosinasi negli insetti. Un altro risultato dell’attività della 
proteina negli invertebrati è la formazione del bisso nel mitilo. Fra i mammiferi, la 
colorazione della pelle e dei capelli sono causati dalla melanina, prodotto della 
tirosinasi (Hearing, 1991).  
1.1.2.1 Il sito attivo della tirosinasi. 
 
Sono stati effettuati molti studi sulla struttura dei siti attivi delle proteine del 
gruppo III (con metodiche di tipo chimico e analisi spettroscopiche) e in 
particolare della proteina tirosinasi e della sua attività catalitica. Da questi studi è 
emerso che, nel sito attivo della tirosinasi, gli ioni Rame presentano proprietà 
simili alle emocianine e alle catecolo ossidasi (Decker, 2000).  
Sono stati sintetizzati chimicamente modelli dei siti attivi binucleari del tipo III 
(Kenneth, 1993, Fernandes, 2001; Gupta, 2001) e sono stati fatti degli studi 
quantomeccanici sulla attività della tirosinasi, anche recentemente (Lind, 1999). 
Queste indagini strutturali possono fornire delle utili indicazioni sulla geometria e 
le caratteristiche elettroniche del sito attivo.  
Dal momento che non è stato ancora possibile effettuare la diffrazione ai raggi X 
della proteina, queste informazioni devono essere analizzate con attenzione, 
considerandone anche le limitazioni. 
Il sito attivo della proteina può essere in varie forme, in funzione del fatto che vi 
sia o meno il legame con l’ossigeno.