Studio dell'azione apoptotica del cadmio sul testicolo del teleosteo marino Gobius niger

 10
nella posizione P1 del sito catalitico. Si tratta dell’enzima effettore del 
processo apoptotico. Questo enzima, in forma di pro-caspase e quindi 
inattivo, è presente in qualsiasi tipo cellulare. 
Nel presente lavoro di tesi l’espressione del gene della caspase 3 è stata 
studiata mediante RT-PCR semiquantitativa. Il gene è stato parzialmente 
clonato e sequenziato e la quantificazione è stata effettuata mediante 
l’utilizzo della β-actina come standard interno.  
I risultati ottenuti dimostrano come ci sia un aumento significativo 
(P<0,05) dell’espressione genica nei trattati rispetto ai controlli ed, in 
particolare, nei trattati a dose più elevata di Cd. Inoltre, mediante 
Western blotting è stata evidenziata la presenza della pro-caspase 3 in 
tutti gli esemplari studiati, mentre  la caspase 3 attiva è stata osservata 
solo in organismi esposti al Cd.  
 In questo studio è stata considerata anche l’espressione della Heat Shock 
Protein 70 (HSP70), proteina della famiglia delle chaperonine, molecole 
coinvolte nel folding proteico e nel recupero della struttura e della 
funzione di proteine sottoposte a stress. HSP70 viene considerata uno dei 
principali fattori antiapoptotici poiché è in grado di inibire l’apoptosi 
caspase dipendente. 
Mediante un approccio biomolecolare è stata rilevato un aumento 
significativo (P<0,05) dell’espressione genica dell’HSP70 nei trattati 
 11
rispetto ai controlli. Il dato mette  in evidenza un crescente stato di stress 
negli organismi correlato con l’aumento della concentrazione di Cd 
nell’acqua. 
In conclusione i dati raccolti in questo lavoro suggeriscono come la 
presenza di Cd nell’ambiente acquatico marino, induca l’attivazione di 
un pathway apoptotico caspase-dipendente  nel testicolo di individui 
adulti.  
I maschi di G. niger per evitare che le cellule del testicolo vadano in 
apoptosi, in seguito ad esposizione al Cd, sintetizzano alti livelli di 
HSP70. L’aumento di HSP70, riscontrato nel testicolo alle dosi di Cd 
utilizzate nel presente studio, non è risultato sufficiente per bloccare il 
processo apoptotico. Questo risultato è in accordo con quanto osservato 
da precedenti studi condotti sulla carpa comune Cyprimus carpio ( Ali et 
al., 2003). 
 
 
 
 
 
 
 
 12
1. INTRODUZIONE 
1.1 Apoptosi e necrosi 
Il termine apoptosi che letteralmente in greco significa “caduta di foglie” 
è stato introdotto per la prima volta nel 1972 per indicare un processo di 
morte programmata che la maggior parte delle cellule è in grado di 
attivare per autodistruggersi scomparendo senza lasciare traccia (Kerr et 
al., 1972).  
Esistono due diversi meccanismi messi in atto dalla natura per provocare 
la morte della cellula:  la necrosi  e l’apoptosi.  
Il  primo meccanismo è un evento  accidentale  causato da agenti chimici 
o fisici, che determina il rigonfiamento e la lisi della cellula con il 
rilascio di  materiale citoplasmatico nell’ambiente circostante. Il 
processo necrotico interessa un numero elevato di cellule di un tessuto ed 
è spesso causa di infiammazione e  complicanze nella funzionalità del 
tessuto colpito. 
 L’apoptosi  è invece una forma di  suicidio cellulare che interessa una 
singola cellula  che scompare senza dar luogo a fenomeni infiammatori e 
necrotici. Si tratta di un processo ampiamente osservato in natura indotto 
da una varietà di stimoli come citochine, ormoni steroidei, virus e insulti 
di natura tossica.  
 13
In cellule di organismi animali l’apoptosi è inizialmente visibile 
morfologicamente in quanto la cellula subisce cambiamenti morfologici 
evidenti come : 
la condensazione e frammentazione della cromatina nucleare 
la compattazione degli organelli citoplasmatici 
 la  dilatazione del reticolo endoplasmatico 
 la diminuzione del volume cellulare  
alterazioni nella struttura della membrana plasmatica.  
 
Inoltre, piccoli frammenti di materiale nucleare possono raggiungere la 
membrana plasmatica, dove sono circondati da evaginazione della 
membrana stessa che conferiscono alla cellula un aspetto a bolle 
(blebbing). Questi blebs si staccano dal corpo cellulare trascinando con 
sé parte del citoplasma e del materiale nucleare, dando origine ai “ corpi 
apoptotici” che vengono fagocitati dalle cellule vicine.  
La figura qui di seguito mostra la sequenza di eventi alla base dei 
cambiamenti morfologici che avvengono in una cellula in apoptosi.  
 
 
 
 
 14
 
 
 
 
Fig. 1 Cambiamenti morfologici di una cellula in apoptosi 
 
 
Per quanto possa sembrare drammatica, la morte cellulare programmata 
è un evento fisiologicamente normale e necessario per la sopravvivenza 
di un organismo pluricellulare, in cui è fondamentale l’equilibrio  tra la 
produzione di nuove cellule e  l’eliminazione delle cellule “vecchie” che, 
geneticamente danneggiate o infettate da agenti patogeni, non sono più 
in grado di assolvere i loro compiti.   
 15
Sia nel corso dello sviluppo embrionale che post-embrionale molte 
cellule mettono in atto il loro programma di morte. L’apoptosi infatti  è 
essenziale per il raggiungimento della maturità morfologica e funzionale 
di molti organi e sistemi.  
Ne sono un esempio la formazione delle dita della mano, il 
riassorbimento della coda nei girini, la formazione della rete neurale, la 
regressione del  dotto di Muller o del dotto di Wolff  durante lo sviluppo 
sessuale. 
L’apoptosi è anche coinvolta in altri eventi fisiologici come la selezione 
timica (McDonald et al., 1988), l’uccisione del bersaglio nelle reazioni di 
citotossicità (Cohen et al., 1992), l’atrofia tissutale endocrino-dipendente 
(Kyprianou et al, 1988). 
 
Bisogna ricordare che l’importanza della morte cellulare programmata è 
rimasta a lungo incompresa e solo recentemente sono state riconosciute 
le sue implicazioni in un numero molto elevato di processi cellulari alla 
base di diverse malattie. Fra le più significative le neoplasie, associate ad 
un aumento della sopravvivenza cellulare e le neurodegenerative 
associate ad un aumento di apoptosi come riportato nell’elenco qui di 
seguito. 
 
 16
 
Malattie associate ad un aumento della sopravvivenza cellulare 
Cancro 
 
Malattie associate ad un aumento dell’apoptosi 
AIDS 
Malattie neurodegenerative 
Morbo di Alzheimer 
Morbo di Parkinson 
Sclerosi laterale amiotrofica 
Retinite pigmentosa 
Sindromi mielodisplastiche 
Anemia aplastica 
Danni ischemici 
Infarto al miocardio 
Ictus 
Epatopatie indotte da alcool 
 
 17
1.2 Meccanismi  molecolari del processo apoptotico 
 
I meccanismi genetici, biochimici e molecolari alla base del processo 
apoptotico sono stati ottenuti da studi condotti sul nematode 
Caenorabditis elegans. Nel corso dello sviluppo  dell’animale, 131 delle 
1090 cellule che costituiscono l’embrione si  suicidano secondo 
localizzazioni e tempi geneticamente predefiniti.  
In questo evento risulta coinvolta una famiglia di geni chiamati ced (cell 
death) che svolge un ruolo di regolazione del processo. In particolare si è 
visto come il suicidio venga attuato solo da quelle cellule che esprimono  
i geni ced3 e ced4  i quali  codificano proteine indispensabili per 
l’esecuzione dell’apoptosi : infatti il gene ced3 codifica una proteasi 
citoplasmatica in grado di tagliare specifici substrati dopo essere stata 
precedentemente attivata mediante taglio proteolitico da parte della  
proteina ced4. 
L’importanza  della proteina ced3 deve essere ricercata nella sua 
capacità di inattivare proteine indispensabili per la sopravvivenza della 
cellula come ad esempio enzimi coinvolti nella riparazione del DNA.  
Mutazioni che compromettano la funzionalità di ced3 e ced4 permettono 
la sopravvivenza di cellule destinate a morire.  
 18
E’ stato proposto che i prodotti di questi due geni siano tossici per le 
cellule o comunque permettano la formazione di composti tossici da 
parte di altri metaboliti (Ellis e Horvitz, 1986; Yuan e Horvitz, 1990). 
Un altro gene appartenente alla famiglia ced è ced9  che agisce da  
regolatore negativo del processo apoptotico inibendo l’attività dei geni 
precedenti (Hengartner et al., 1992). ced9, infatti, agisce su ced4 
sequestrandola nel citoplasma in modo da impedirne il legame a ced3, 
l’apoptosi risulta così bloccata. La proteina ced9 sembra abbia il compito 
di impedire la morte di tutte quelle cellule dell’embrione destinate a 
sopravvivere comportandosi  come un “commutatore binario” che regola 
la scelta tra la vita e la morte (Scott F.Gilbert, 1996). 
 
 
 
 19
I meccanismi d’azione che regolano ced9 e le modalità con cui questo 
gene agisce una volta attivato non sono ancora del tutto chiari. 
Comunque , grazie ad uno studio di genetica condotto su Drosophila 
melanogaster  è stato possibile arrivare ad una maggiore  comprensione 
del sistema che permette alla cellula di integrare i diversi segnali e 
attuare così il suo programma di morte (White et al., 1996; Pronk et al., 
1996). Alcuni ricercatori, infatti, hanno isolato dal moscerino della frutta 
un gene, chiamato successivamente reaper, che codifica un polipeptide 
di 65 aminoacidi. Questa proteina, che non ha nessuna omologia con altri 
peptidi noti, sembra svolgere in D. melanogaster  il ruolo di coordinatore 
e regolatore dell’apoptosi. A questa conclusione si è giunti osservando 
che, nonostante mutanti per delezione del gene reaper mostrino 
soppressione dell’apoptosi, la morte cellulare può comunque essere 
indotta in embrioni privi dello stesso gene. Tutto questo ha permesso di 
avanzare l’ipotesi secondo la quale reaper non è un semplice effettore 
del processo apoptotico ma sicuramente è chiamato in causa per svolgere 
un ruolo ben più complesso purtroppo al momento non ancora 
caratterizzato. Nei Mammiferi la situazione è molto più complessa, 
tuttavia è stato possibile identificare degli analoghi funzionali e 
strutturali delle proteine ced. Si tratta di un gruppo di specifiche proteasi 
per cisteina e aspartato/ ced3 simili conosciute come ICE (Interleukin-1β 
 20
convertine enzyme) o CASPASI (cysteinyl-aspartate-specific 
proteinases), proteasi contenenti cisteina caratterizzate da un’assoluta 
specificità per residui di aspartato nella posizione P1 del sito catalitico. Il 
taglio proteolitico delle caspasi è fondamentale per l’inizio del processo 
apoptotico e può avere diversi effetti come ad esempio la perdita 
dell’attività biologica della proteina bersaglio.  
Le caspasi , nella cellula non apoptotica, vengono  sintetizzate in forma 
di precursore inattivo costituito da un prodominio all’estremità ammino-
terminale seguito da sequenze che codificano due subunità, generalmente 
di 10 e di 20 kDa (P10 e P20) , legate covalentemente o separate da un 
peptide linker. In condizioni di riposo i precursori sono liberi in forma 
monomerica e a bassa concentrazione nel compartimento citoplasmatico. 
Solo all’arrivo di determinati stimoli si innesca il piano di morte 
cellulare che determina l’attivazione del precursore mediante un taglio 
specifico in un residuo di cisteina per generare la forma matura 
dell’enzima, in cui l’estremità N-terminale viene rilasciata e le due 
subunità, P10 e P20, si complessano a formare un tetrametro.