Specificità mutazionale dei ceppi di Bacillus subtilis alterati nei geni coinvolti nel sistema di riparazione degli appaiamenti scorretti o MMR

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un aumento della variabilità genetica in risposta alle variazioni ambientali esterne) 
ed infine la produzione di enzimi idrolitici e di antibiotici. Si ritiene che in natura 
B. subtilis sia soprattutto presente sotto forma di spora o come cellula in fase 
stazionaria quiescente ed a bassa attività metabolica. 
E’ possibile analizzare tutte queste caratteristiche alla fine della crescita 
esponenziale e durante la fase stazionaria della vita del batterio (Dubnau, 1993).  
Il B. subtilis è utilizzato come modello per lo studio sia dal punto di vista 
genetico che biochimico dei batteri Gram
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 ed è il batterio meglio caratterizzato 
dopo E. coli. 
 
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1.2 Competenza naturale e trasformazione 
 
La competenza è uno stato fisiologico che conferisce alle cellule batteriche 
la capacità di importare attivamente DNA esogeno e quindi di aumentare la 
propria variabilità attraverso processi di ricombinazione. 
In B. subtilis tale processo si sviluppa tardivamente nella fase di crescita 
esponenziale all’inizio della fase stazionaria ed interessa una sottopopolazione di 
cellule (1-10%).  
Sono stati individuati 40 geni coinvolti nelle fasi iniziali della competenza 
e alcuni di essi giocano un ruolo importante anche nelle fasi iniziali del processo 
di sporificazione (geni spo0). Diverse funzioni e strategie regolative che sono 
richieste per il processo di sporificazione sono anche richieste per lo sviluppo 
della competenza (Spo0A, Spo0B, Spo0F, Spo0H, Spo0K), ma sembra che i due 
processi si escludano vicendevolmente, in quanto l’instaurarsi dell’uno inibisce il 
progredire dell’altro (i geni sinI e abrB inibiscono la competenza e sono regolati 
dalla sporificazione, rapA blocca la sporificazione ed è importante per la 
competenza) (Grossman, 1995). 
L’instaurarsi della competenza avviene grazie all’integrazione di alcuni 
segnali fisiologici captati da un sistema a due componenti ComP/ComA, 
composto da una cinasi (ComP) in grado, in seguito ad interazione con un segnale 
esterno, di autofosforilare un residuo aminoacidico istidina (altamente conservato, 
tra le proteine appartenenti a questa famiglia) mediante ATP (figura 1). L’altro 
elemento (ComA) è spesso rappresentato da un fattore di trascrizione, che agisce 
da effettore, cui la cinasi trasferisce il gruppo fosforico ad un residuo di aspartato. 
ComA agisce attivando il gene comS (situato all’interno dell’operone srfA) che 
codifica per una proteina (ComS) che porta all’attivazione di ComK, fattore di 
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trascrizione che promuove la sua stessa espressione e quella dei geni tardivi com 
(presenti in elevata concentrazione solo nella cellula in fase di competenza)
 
(Grossman, 1995).  
Per il differenziamento dello stato di competenza sono importanti due 
fattori extracellulari: ComX (un ferormone) e CSF (Competence Stimulating 
Factor). L’interazione fra questi due fattori ed il sistema a due componenti 
precedentemente illustrato determina l’insorgere di una serie di eventi a cascata 
che portano all’attivazione di ComK. Quest’ultimo  fattore di trascrizione sembra 
subire una regolazione negativa operata dai prodotti dei geni mecA e mecB in 
quanto mutazioni a carico di questi due geni portano ad un incremento 
dell’espressione di ComK e dei geni tardivi com. MecA, inseguito all’interazione 
con MecB, agisce bloccando ComK mentre ComS attiva ComK interagendo con 
le proteine Mec. ComK si trova anche sotto il controllo dei prodotti di altri geni 
quali abrB, sinR, degU, poiché mutazioni a carico di questi geni comportano 
difetti nello sviluppo della competenza, difetti che sono eliminati da mutazioni a 
carico dei geni mec. Non è ancora chiaro con quale meccanismo essi agiscano 
(Grossman, 1995). 
ComX (prodotto come precursore successivamente processato da ComQ e 
poi esportato) interagisce con il complesso ComP/ComA, CSF viene portato 
all’interno della cellula ad opera di una permeasi ATP dipendente (SpoOK) dove 
determina un accumulo di ComA fosforilata. Di CSF non si conosce con esattezza 
l’origine, ma si è osservato che in mutanti spo0A
-
, spo0B
-
, spo0F
-
, spo0H
- 
 si ha 
una produzione ridotta di CSF e che è sotto controllo negativo da parte di AbrB. 
 
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Durante il processo di trasformazione il DNA esogeno, a doppio filamento, 
viene portato  attivamente all’interno della cellula e trasformato in DNA a singolo 
filamento a seguito di un taglio operato da una endonuclesi specifica cui segue 
una degradazione esonucleolitica. La maggior parte dei tratti a singolo filamento 
si integrano sul cromosoma batterico sostituendosi cosi’ ai frammenti di DNA 
omologhi della cellula ricevente mediante processi di ricombinazione RecA 
dipendenti (Claverys, Lacks, 1986). 
Il sistema di trasformazione naturale permette di effettuare sia l’analisi 
genetica fine di una regione cromosomica, sia la manipolazione genica 
(introduzione di geni di interesse in punti specifici del cromosoma). Per analogia 
con quanto osservato in Streptococcus pneumoniae si ritiene che al processo di 
trasformazione possano partecipare anche i geni coinvolti nel mismatch repair 
(MMR) contrastando la ricombinazione e quindi la possibilità di integrazione nel 
genoma ricevente di sequenze non omologhe, costituendo uno degli elementi della 
barriera interspecifica. 
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1.3 Sporificazione      
 
Le spore batteriche sono strutture cellulari specializzate per la 
sopravvivenza anche in condizioni ambientali sfavorevoli. Tali strutture sono 
prodotte attivamente all’interno della cellula vegetativa e vengono denominate 
endospore.  
Il B. subtilis è caratterizzato dalla formazione di spore ovoidali. In una 
coltura di laboratorio è possibile osservare la comparsa di spore alcune ore dopo la 
fine della fase di crescita logaritmica, stadio caratterizzato dall’esaurimento della 
maggior parte delle sostanze nutritive. 
Le spore sono cellule metabolicamente inattive e si trovano in uno stadio 
di vita latente detto criptobiosi. La spora è in grado di resistere all’attacco di molti 
fattori esterni quali temperatura, agenti chimici, antibiotici, radiazioni ionizzanti e 
ultraviolette e possono sopravvivere per un lungo periodo di tempo. 
Le caratteristiche della spora possono essere analizzate sia attraverso 
l’utilizzo del microscopio elettronico sia attraverso l’analisi chimica dei vari 
componenti. Tali studi hanno permesso di ricavare il seguente quadro:  
 ξ al centro si trova il citoplasma in quantità ridotta , in cui si riscontra la 
presenza di ribosomi, DNA e acido fosfoglicerico usato come riserva energetica  
 ξ tale citoplasma è a sua volta delimitato da una membrana derivante dalla 
membrana endoplasmatica della cellula madre  
 ξ la membrana è poi circondata dalla corteccia, uno spesso strato costituito da 
un peptidoglicano modificato (che conferisce alla spora resistenza al lisozima ed 
elasticità) 
 ξ all’esterno della corteccia si trova una membrana con polarità opposta rispetto 
alla membrana citoplasmatica 
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 ξ esternamente si ha la tunica, un rivestimento proteico costituito da diversi 
strati di catene polipeptidiche simili alla cheratina che conferisce resistenza agli 
agenti chimici. 
La resistenza della spora è quindi determinata da tutti questi componenti. 
Ad esempio l’acido dipicolinico contenuto all’interno del citoplasma contribuisce 
alla resistenza al calore riducendo il contenuto d’acqua. La tunica e la corteccia 
fungono da barriera all’ingresso di sostanze esterne. L’endospora è caratterizzata 
da un efficace meccanismo di riparazione dei danni provocati al DNA, in seguito 
ad esposizione a radiazioni ultraviolette, che entra in funzione nella primissima 
fase della germinazione costituito da una fotoliasi specifica per il particolare 
fotoprodotto SP (timidinil timidina) della spora. Infine la presenza di proteine a 
basso peso molecolare, denominate SASP (Small Acid Soluble Proteins) fornisce 
un’ulteriore protezione del DNA ed un’ulteriore riserva di aminoacidi e energia 
per la germinazione. 
 
1.3.1 Il processo di sporificazione 
Il processo che porta alla formazione delle spore può essere diviso dal 
punto di vista morfologico in sette stadi alcuni dei quali funzionalmente definiti 
dall’esistenza di specifici mutanti (figura 2)
 
(Errington, 1993). 
 ξ  stadio 0     è uno stadio preparatorio. La cellula si trova nello stadio 
vegetativo alla fine della fase di crescita esponenziale 
 ξ  stadio I    si ha la condensazione del cromosoma con la formazione di un 
filamento assiale 
 ξ  stadio II   si ha la formazione di un setto derivante dalla invaginazione della 
membrana citoplasmatica che genera due compartimenti all’interno della cellula 
in cui quello di dimensioni minori, detto prespora, è destinato a diventare la spora, 
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mentre quello di dimensioni maggiori è la cellula madre. Insieme formano lo 
sporangio 
 ξ  stadio III    la membrana citoplasmatica del compartimento maggiore si 
estende ed avvolge la prespora che sarà così avvolta da due membrane una interna 
e l’altra esterna, con polarità inverse 
 ξ  stadio IV  si forma la corteccia  
 ξ  stadio V   contemporaneamente alla formazione della corteccia inizia la 
formazione della tunica esternamente alla seconda membrana  
 ξ  stadio VI  la spora raggiunge la completa maturazione  
 ξ  stadio VII   la spora viene liberata dalla cellula madre che si disgrega per 
azione di enzimi litici  
Lavorando in condizioni sperimentali controllate B. subtilis completa il 
processo in circa 6/8 ore (Doi, 1989). 
Durante questo processo si osserva un’elevata attività biosintetica con 
comparsa di nuove attività enzimatiche coinvolte nella sintesi delle strutture della 
spora.  
La sintesi del DNA cessa precocemente, all’incirca durante lo stadio 0, con 
il completamento della replicazione dei cromosomi. Durante la sporificazione 
vengono sintetizzati nuovi mRNA e si osserva la secrezione da parte delle cellule 
di numerosi enzimi (quali proteasi, nucleasi e amilasi) e di sostanze dotate di 
attività antibiotica. Nel caso del B. subtilis si producono micobacillina, subtilina e 
surfattina.  
Gli esoenzimi prodotti contemporaneamente alle fasi iniziali del processo 
di sporificazione, sono enzimi idrolitici la cui funzione potrebbe essere quella di 
degradare le macromolecole, consentendo di riutilizzare i monomeri quali 
amminoacidi, basi e zuccheri per la sintesi di macromolecole specifiche della 
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spora. Tuttavia queste funzioni probabilmente non sono essenziali per il processo 
di sporificazione in quanto sono stati trovati mutanti incapaci di produrre un 
enzima attivo e ancora capace di sporificare.  
Allo stesso modo durante gli altri stadi si possono osservare attività 
enzimatiche specifiche o comunque difficilmente osservabili durante la crescita 
vegetativa che si susseguono in una determinata sequenza. Un evento morfo-
funzionale che si realizza tardivamente durante la sporificazione non può avvenire 
se prima non hanno avuto luogo tutti gli altri eventi che lo precedono in tale 
sequenza. Si è osservato che se nelle prime fasi di tale processo si aggiunge 
glucosio, una fonte ricca di carbonio, al terreno di coltura si ritarda la 
sporificazione. Esiste però un punto di non ritorno, oltrepassato il quale il 
fenomeno non è più reversibile e quindi anche dopo l’aggiunta di un inibitore 
della sporificazione quale il glucosio il processo procede. 
 
1.3.2 Meccanismi che regolano la sporificazione.
  
  
Sono stati individuati mutanti batterici (soprattutto nel B. subtilis) incapaci 
di sporificare detti spo
- 
che possono essere bloccati in diversi stadi della 
sporificazione (spo0, spoII, etc.). I geni responsabili della sporificazione sono 
circa un centinaio distribuiti su tutta la mappa, non raggruppati in clusters: infatti 
non esiste una relazione tra la posizione del gene nella spora e lo stadio della 
sporificazione da esso controllato.    Non si conosce con esattezza il segnale che 
induce tale processo, ma esistono delle indicazioni che uno dei segnali chimici è 
rappresentato dall’abbassamento della concentrazione intracellulare del GTP (i 
dati sono stati ottenuti da studi condotti su mutanti e dal fatto che inibendo la 
sintesi di GTP si induce sporificazione).