Analisi delle distanze genetiche in orzo mediante l'uso di marcatori molecolari

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apprezzabili morfologicamente o attraverso l'esame elettroforetico 
della composizione enzimatica o proteica. L'organizzazione 
internazionale che tratta l'argomento dell'identificazione delle 
varietà, attraverso metodi di laboratorio, è l'ISTA (International 
Seed Testing Association) il cui scopo è di normalizzare le 
metodologie di analisi delle sementi. In seno all'ISTA è attivo un 
gruppo che si occupa di test biochimici per l'identificazione di 
varietà. L'ISTA ha, sin dal 1986, riconosciuto l'elettroforesi tra le 
metodologie idonee alla caratterizzazione varietale. Fino ad oggi 
sono state adottate procedure normalizzate per frumento e orzo 
basate essenzialmente sulla metodologia PAGE (elettroforesi in gel 
di poliacrilamide) e un protocollo del metodo SDS-PAGE per 
pisello e loietto. Nello sviluppo di nuove metodologie per la 
normalizzazione, l'ISTA ha raccomandato i seguenti principi: analisi 
rapida, costi accessibili, livello appropriato di discriminazione tra le 
varietà, adeguata riproducibilità, assenza di reattivi tossici ed 
applicabilità ad un elevato numero di sementi isolate. 
I marcatori biochimici rappresentano un valido complemento 
alla valutazione morfologica delle varietà vegetali. Tra tali 
marcatori troviamo, ad esempio, profili isoenzimatici (Stuber e 
Goodman, 1983) e profili elettroforetici cromatografici di proteine 
di riserva del seme (Nucca et al., 1978; Smith e Smith, 1987) o 
dell'embrione (Damerval et al., 1987). Questi marcatori sono infatti 
stabili e si trasmettono secondo gli schemi della genetica 
mendeliana. Tali caratteristiche hanno suggerito all'ISTA di 
riconoscere l'applicazione di tecniche elettroforetiche come utile 
strumento per la caratterizzazione delle varietà vegetali. L'impiego 
di analisi elettroforetiche e cromatografiche su sistemi isoenzimatici 
e sulle proteine di riserva del seme ha già trovato applicazione, dal 
punto di vista giuridico, nella causa intentata dalla Pioneer Hi-Bred 
International contro la Holden per accertare l'impiego, nei 
programmi di miglioramento di quest'ultima, di linee pure di mais 
dotate di elevato valore agronomico di proprietà della Pioneer.  
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Il confronto di diversi caratteri biochimici delle linee oggetto 
di indagine ha avuto un ruolo predominante per la formulazione 
finale del verdetto, favorevole alla Pioneer. 
La certificazione varietale è oggetto delle normative 
comunitarie e dell'OECD (Organizzazione per la Cooperazione e lo 
Sviluppo Economico). Nel contesto della certificazione delle 
sementi la verifica dell'identità varietale avviene: in sede di 
controllo in campo e in sede di post-controllo. L'OECD nel definire 
lo schema per la certificazione varietale delle sementi di frumento 
ibrido (1988) ha riconosciuto che le metodologie biochimiche come 
l'elettroforesi sarebbero state essenziali per la verifica dell'identità e 
la purezza delle sementi ibride. La Comunità Europea stessa ha 
indirettamente riconosciuto la validità del metodo elettroforetico 
richiamandone l'utilizzazione in atti ufficiali quale la decisione del 
1990 (decisione 89/540/CEE del 22.9.89) sull'esperimento sulle 
ispezioni non ufficiali in campo e adottandolo nel campo 
comparativo comunitario del girasole, della soia e dell'asparago. 
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§2. CATEGORIE  DI  MARCATORI MOLECOLARI 
2.1 RFLP (Restriction Fragment Length Polymorphism: 
polimorfismi dei frammenti di restrizione) 
La scoperta degli enzimi di restrizione di origine batterica, 
capaci di operare un taglio in punti precisi del DNA e 
successivamente lo sviluppo della tecnologia del "clonaggio 
genico", che ha permesso l'isolamento e la manipolazione di spe-
cifici frammenti di DNA, sono alla base della metodologia 
molecolare RFLP. 
L'utilizzazione degli RFLP come marcatori molecolari fu 
suggerita da Botstein e colleghi nel 1980. Questi autori furono i 
primi a proporre la valutazione delle differenze tra individui a 
livello di sequenze nucleotidiche del DNA. Infatti fu trovato che la 
lunghezza o la dimensione dei frammenti di restrizione di un dato 
locus del cromosoma ottenuti dopo digestione enzimatica variava in 
individui della stessa specie e di specie diverse. Queste differenze 
furono denominate polimorfismi della lunghezza del DNA, poi 
utilizzati come marcatori molecolari originariamente in studi di 
genetica umana per la realizzazione di mappe di associazione ge-
netica (Botstein et al., 1980; Donis-Keller et al., 1987). 
L'analisi degli RFLP consiste nella valutazione delle 
differenze in peso molecolare di frammenti di restrizione omologhi 
ottenuti digerendo il DNA genomico con enzimi di restrizione. La 
presenza di tali polimorfismi è conseguenza diretta della variabilità 
naturale esistente nelle sequenze delle basi del DNA di individui 
geneticamente differenti. Questa variabilità è messa in evidenza 
grazie all'uso degli enzimi di restrizione, endonucleasi batteriche, 
capaci di tagliare il DNA a doppia elica (digerendo il legame 
fosfodiesterico della catena nucleotidica) in punti specifici, 
generalmente sequenze lunghe da 4 a 8 coppie di basi diverse per 
ciascun enzima. Nei batteri queste molecole sono state sviluppate 
come difesa contro aggressioni da parte di virus: l'organismo 
invasore viene reso inoffensivo operando una serie di tagli nel suo 
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DNA. Il DNA batterico, a sua volta, non resta vittima dell'enzima 
poiché ha mascherato, con una reazione di metilazione, la sequenza 
di basi riconosciuta da quell'enzima di restrizione. 
L'origine del polimorfismo RFLP è riconducibile a tre eventi 
possibili: 1) mutazione al sito di restrizione per la sostituzione di 
una o più basi che possono creare o eliminare siti di restrizione; 2) 
riarrangiamenti nella regione cromosomica compresa tra i siti di 
restrizione per l'inserzione o delezione di alcune basi; 3) la presenza 
di uno o più siti di citosina metilati al sito di restrizione. Infatti 
alcuni enzimi non sono in grado di tagliare il DNA se la sequenza di 
riconoscimento presenta metilazione. Questi enzimi possono quindi 
evidenziare polimorfismi se c'è variazione nella metilazione ai siti 
di restrizione. I siti di restrizione sono distribuiti nel DNA di una 
data specie in modo casuale e vengono trasmessi alla progenie in 
modo mendeliano: nell'ambito della stessa specie occupano 
posizioni costanti sul cromosoma. Il DNA genomico sottoposto 
all'azione degli enzimi di restrizione viene pertanto tagliato in 
frammenti la cui lunghezza è determinata dalla posizione sul 
cromosoma dei siti di restrizione. 
Esiste polimorfismo della lunghezza dei frammenti di 
restrizione perché esiste variabilità nel DNA di organismi diversi. 
Una sequenza di DNA può mutare in lunghezza in seguito ad eventi 
di inserzione e delezione. Tale situazione porta alla perdita di siti di 
restrizione, oppure alla creazione di nuovi siti di taglio o ancora a 
variazione nella lunghezza dei frammenti di restrizione. Il filamento 
di DNA viene tagliato in una serie di frammenti la cui lunghezza e 
numero dipende dallo specifico enzima utilizzato e dal numero dei 
siti di restrizione distribuiti lungo il DNA. In individui 
geneticamente diversi per la localizzazione dei siti di restrizione, 
saranno quindi prodotti frammenti di lunghezza e di peso molecolare 
diversi. Infatti, se un sito di restrizione va incontro a una mutazione, 
per cui non viene riconosciuto dall'enzima specifico, si avrà la 
formazione di due alleli (uno tagliato e l'altro no) che possono 
essere evidenziati in quanto vengono prodotti segmenti di DNA con 
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lunghezza diversa. Questa differenza allelica (polimorfismo) 
relativa ai siti di restrizione, per il fatto che produce frammenti di 
DNA di lunghezza variabile, è quindi alla base dei polimorfismi 
RFLP. 
La variabilità relativa alla lunghezza dei frammenti viene 
evidenziata per mezzo dell'elettroforesi su un gel di agarosio o 
poliacrilamide in cui la posizione dei frammenti è proporzionale al 
loro peso molecolare e alla loro lunghezza, e da qui trasferiti per 
capillarità su un supporto solido quale una membrana di nylon o 
nitrocellulosa (Southern blotting). Anche se separati per 
elettroforesi, i frammenti di DNA presenti sulla membrana, non 
possono essere messi in evidenza indiscriminatamente, in quanto i 
frammenti sono moltissimi e si osserverebbe una striscia continua e 
non delle bande distinguibili. Infatti il DNA genomico digerito con 
un enzima di restrizione dà luogo ad un numero praticamente 
infinito di bande che vengono visualizzate come una striscia. Quindi 
per evidenziare solo una parte dei frammenti presenti sulla 
membrana, questi vengono dapprima denaturati, trasferiti su 
membrana e poi ibridizzati con delle sonde, anch'esse denaturate, 
marcate con fosforo radioattivo. Quando le sonde incontrano una 
sequenza complementare nel DNA presente sulla membrana, si 
ibridizzano ad essa e vi restano fissate (la sonda si lega solo con il 
frammento/i che contiene tutta o parte della sequenza 
complementare di  basi). Se la sonda utilizzata per l'ibridazione è 
complementare con questi frammenti di DNA differenti tra genotipi, 
essa evidenzia un RFLP. La membrana è quindi collocata su una 
pellicola autoradiografica ed i frammenti di DNA ibridizzati con la 
sonda vengono visualizzati sulle pellicole come bande dovute 
all'emissione di particelle beta da parte del fosforo radioattivo. 
Quindi solo le bande che contengono sequenze complementari alla 
sonda verranno individuate come segnali autoradiografici alla fine 
dell'esperimento. Il numero delle bande varierà da una a poche 
unità.