Espressione selettiva della survivina e sua regolazione nella Sclerosi Tuberosa, una patologia multisistemica

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iassunto
La tuberina è coinvolta nel traffi co vescicolare, nella regolazione del ciclo cellulare 
e nella funzione degli ormoni steroidei. L’inattivazione di tuberina può stimolare la 
proliferazione cellulare, come avviene nell’angiomiolipoma o causare un incompleto 
differenziamento cellulare, caratteristica dei tuberi encefalici dei pazienti affetti da TSC.
La mancata interazione tra amartina e tuberina è stata ricondotta alle manifestazioni 
della TSC. Le due proteine interagiscono tra di loro e dati sperimentali, in vivo ed in 
vitro, indicano che esse regolano la proliferazione e il differenziamento cellulare.
Infatti la mancata attività funzionale del complesso, come si verifi ca nella Sclerosi 
Tuberosa, comporta un’alterazione della divisione cellulare che si manifesta nella 
maggior parte dei casi con lo sviluppo di iperplasie a carico di vari organi. 
Un’alta percentuale dei pazienti affetti da TSC presenta complicanze rappresentate 
da masse addominali che si formano in prossimità dei reni e del fegato. Queste masse 
sono gli angiomiolipomi che non pongono pericoli per il paziente se non qualora inizino a 
sanguinare e diventa quindi opportuno asportarli. Nel caso del rene, spesso la crescita della 
massa è tale che ingloba il rene stesso, alterandone l’organizzazione del parenchima. 
In vari casi di neoplasia si sono riscontrati dei livelli elevati di espressione di 
survivina che sembra essere correlata ad un aumento del tasso di proliferazione 
cellulare. Poichè anche nella TSC vi è un disregolazione nella proliferazione, abbiamo 
pensato ad un eventuale ruolo di survivina nella sopravvivenza di queste cellule.
I livelli di espressione di survivina variano in maniera caratteristica in funzione 
delle diverse fasi del ciclo cellulare. La ricerca dei segnali molecolari che controllano 
l’espressione di survivina ha fornito risultati interessanti ed ha mostrato che esistono 
molteplici vie molecolari in grado di regolarne l’espressione. Il denominatore 
comune è però risultato essere l’attivazione della via regolata dalla fosfatidil 
inositolo 3 chinasi (PI3K)/Akt e delle MAP chinasi.
La survivina gioca inoltre un importante ruolo nella soppressione dell’apoptosi 
grazie alla sua azione inibitoria diretta ed indiretta sull’attività delle caspasi e delle 
proteasi e nucleasi coinvolte nell’apoptosi. E’ stato osservato come un’aumentata 
espressione di survivina è in grado di bloccare i processi apoptotici che coinvolgono 
alterazioni mitocondriali ma non quelli indotti dai death-receptor come Fas e TNF.
In questo studio si è valutata l’espressione di survivina in differenti lesioni di 
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iassunto
diversi tessuti interessati dalla Sclerosi Tuberosa. Lo scopo di questo elaborato è 
stato quello di chiarire se questo oncogene potesse giocare un ruolo nella regolazione 
dei meccanismi molecolari che sono responsabili della proliferazione e della crescita 
cellulare dei tessuti colpiti dalla patologia.
I risultati degli esperimenti condotti evidenziano per via immunoistochimica 
l’espressione di survivina in rare cellule nelle sezioni di angiomiolipoma, di 
gengiva, di fi broma molle e di cute in pazienti TSC. Nelle cellule purifi cate 
dall’angiomiolipoma la surviviva è fortemente espressa nelle cellule epiteliali (non 
LOH) mentre nelle cellule mioblastoidi LOH sembra non essere espressa. Questi 
dati sperimentali, confermati anche con Western Blotting, sono stati integrati 
con l’inibizione farmacologica di mTOR mediata da rapamicina e LY294002. Si 
osserva così una leggero aumento della quantità sintetizzata di survivina nelle 
cellule mioblastoidi. Anche i fattori di crescita (IGF-I, EGF) sembrano avere attività 
discriminanti sulle due popolazioni cellulari isolate e studiate. Un aumento  di 
espressione di survivna è osservabile qualora le cellule sono mantenute in coltura 
con IGF-I, mentre le cellule epiteliali, a differenza delle muscolari, esprimono al 
proteina anche in medium privato di fattori di crescita.
Nel loro insieme le osservazioni riportate in questa tesi unite ai dati presenti in 
letteratura suggeriscono che la survivina, come nelle cellule tumorali, possa avere 
un ruolo nel favorire la sopravvienza cellulare contrastando i fenomeni fi siologici 
che regolano l’omeostasi tissutale. In futuro la più appropriata caratterizzazione del 
meccanismo attraverso il quale survivina svolge la sua azione nella TSC consentirà 
di chiarire se survivina possa costituire un bersaglio molecolare per lo sviluppo di 
nuove strategie terapeutiche per la Sclerosi Tuberosa.
La conoscenza e la caratterizzazione delle vie molecolari coinvolte nelle principali 
caratteristiche eziopatologiche della Sclerosi Tuberosa consentirà di individuare 
trattamenti farmacologici in grado di migliorare la qualità della vita dei pazienti e 
sarà altresì un importante punto di partenza per l’attuazione e la sperimentazione della 
terapia genica volta a correggere le mutazioni sui geni TSC.
Introduzione
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ntroduzione
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a Sclerosi Tuberosa (Tuberose Sclerosis Complex - TSC) è una malattia 
autosomica dominante. Si defi nisce autosomica per ché non è dovuta ad un 
gene localizzato sull’eterocromosoma X. Dominante, perché l’avere un allele 
normale in aggiunta a quello difet toso non impedisce che la malattia, prima o 
poi, si manifesti. Infatti è stato osservato che soggetti eterozigoti, che hanno 
ereditato un allele difettoso da un genitore ed un allele sano dall’altro, hanno una 
probabilità vicina al lOO% di manifestare nell’arco della loro vita qualche segno 
della malattia. Questo concetto viene anche espresso col termine di penetranza 
quasi completa o con penetrazione incompleta, caratterizzata da lesioni in molti 
organi. In Italia circa 10.000 persone sono affette da Sclerosi Tuberosa.
Il primo riferimento a questa malattia risale al secolo scorso, quando Friedrich 
von Recklinghausen a Berlino ne delineò brevemente i segni anatomopatologi ci. 
Qualche anno dopo (1879), Désiré-Magloire Bourneville, neurologo, coniò il 
termine Sclerosi Tuberosa delle circonvoluzioni cerebrali, intendendo con ciò 
sottolineare l’aumentata consistenza della corteccia e la riduzione della profondità 
dei solchi cerebrali in alcune aree dell’encefalo. Queste aree vengono ancora oggi 
chiamate tuberi corticali. In realtà si tratta di amartomi, cioè di aree popolate da 
diversi tipi di cellule nervose - astrociti e neuroni - stratifi cate in modo irregolare 
rispet to al tessuto cerebrale normale circostante, a causa di anomalie che possono 
essere di migrazione, di proliferazione e di differenziamento. Queste lesioni variano 
per numero e dimensione da individuo a individuo e sono all’origine dei disturbi 
neuro logici della TSC. I primi due pazienti descritti da Bourneville manifestavano 
crisi epilet tiche e ritardo mentale. Il loro viso, specie le guance ed il mento, 
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a Sclerosi 
Tuberosa
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ntroduzione
era pun teggiato da formazioni vescicolo-papulari che richiamavano l’adenoma 
sebaceo. Oggi questi segni cutanei al volto sono riconosciuti essere tipici della 
malattia e chiamati più propriamente angiofi bromi facciali.
2.1   Aspetti epidemiologici
Oggi, anche grazie all’impiego di metodi diagnostici sofi sticati quali la 
Tomografi a Assiale Computerizzata e la Risonanza Magnetica Nucleare, la TSC 
sembra essere molto più frequente di quanto si ritenesse in passato. Stime recenti 
indicano una prevalenza di malati nella popolazione pari a 1 su 6700 individui. È 
probabile che questo numero sia sottostimato a causa della diffi coltà di identifi care 
i portatori di sintomi lievi della malattia.
La caratteristica triade clinica della TSC è rappresentata da epilessia, ritardo 
mentale ed adenoma sebaceo della pelle. Di particolare interesse sono anche le 
complicanze polmonari che si sviluppano nei pazienti che ne sono affetti. Le cellule 
muscolari lisce dei polmoni di pazienti affetti da TSC sono caratterizzate da alterazioni 
molto simili a quelle riscontrate nella LAM (Linfoangioleiomiomatosi), una rara 
malattia polmonare, che si manifesta quasi esclusivamente in giovani donne e che è 
caratterizzata da alterazioni istopatologiche principalmente dovute alla proliferazione 
disorganizzata delle cellule della muscolatura liscia.
La TSC si manifesta a causa di un difetto del gene TSC1 sul cromosoma 9 nella 
regio ne 9q34 o del gene TSC2 sul cromosoma l6p13.3. Fino ad ora, nessun paziente è 
mai risultato portatore di un difetto sia sul gene TSCl che sul gene TSC2; ciò indica che 
il difetto del solo TSCl o del solo TSC2 è suffi ciente a sviluppare la malattia. Inoltre, non 
esistono prove a favore dell’e sistenza di altri geni TSC, nel senso che non sono ancora 
state osservate famiglie in cui la malattia non segregasse né con TSC1 né con TSC2.
Nonostante l’origine della patologia sia ascrivibile a due geni diversi, TSC1 e TSC2, 
la sintomatologia osservata nei vari pazienti risulta paragonabile indifferentemente dal 
gene mutato, anche se recenti osservazioni suggeriscono che le anormalità del gene 
TSC2 siano correlate a manifestazioni peggiori della patologia. I geni TSC1 e TSC2 
codifi cano per due proteine, rispettivamente amartina e tuberina, espresse in maniera 
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ntroduzione
universale  la cui funzione eziopatogenetica non è nota. Gli studi sperimentali condotti 
fi no ad ora si sono occupati di valutarne la funzione; in prevalenza si tratta di studi 
basati sull’espressione esogena delle due proteine in linee cellulari immortalizzate.
È bene ricordare a questo proposito che gli amartomi, anche se talvolta aumentano 
di numero e dimensione col tempo, sono lesioni benigne e non producono metastasi. 
L’incidenza di vere e proprie neoplasie nei malati di TSC non è signifi cati vamente 
diversa da quella della popolazione generale, fatta eccezione per i tumori renali per 
i quali è stato riportato un modesto incremento.
L’idea che i geni TSC controllino non solo la proliferazione ma anche il 
differenziamento cellulare deriva dalla natura stessa dell’amartoma. Infatti, 
sebbene le cellule di un nodulo amartomatoso derivino tutte da una singo la 
cellula progenitrice, esse possono assumere caratteristiche differenziati ve distinte. 
L’angiomiolipoma renale ne è l’esempio più eclatante: di fre quente è composto da 
una mescolanza di cellule adipose, muscolari lisce ed epiteliali.
Esperimenti su topi e ratti knockout TSC1
-/-
 o TSC2
-/-
 hanno dimostrato che le 
due principali proteine codifi cate da questi due geni sono indispensabili durante 
l’embriogenesi: infatti, in completa assenza di tuberina o amartina, la formazione 
dell’embrione non procede oltre i primi stadi di sviluppo.
2.2   Caratteristiche cliniche della patologia
Dal punto di vista clinico la patologia è caratterizzata dal coinvolgimento di molti 
organi e dalla presenza di lesioni specifi che defi nite amartomi. Si tratta di tumori 
benigni costituiti da cellule displastiche e disorganizzate con un potenziale di malignità 
relativamente basso. Anche se ogni organo potrebbe essere colpito, quelli che in genere 
risultano esserlo sono: il SNC, la cute, il rene, il cuore e i polmoni [Hancock E. et al., 
2002; Jimbow K., 1997; Dabora S.L. et al., 2001; Roach E.S. et al., 1998].
Le lesioni presenti a livello del sistema nervoso centrale (fi gura 1) comprendono:
n Νoduli subependimali (prevalenza 80%) che possono essere presenti fin 
dalla nascita e, data la loro caratteristica incorporazione di calcio, sono 
visibili attraverso la TAC encefalica.
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ntroduzione
n Tuberi corticali e subcorticali (prevalenza 
70%) presenti fi n dalla nascita, coinvolgono 
la corteccia cerebrale e la sottostante sostanza 
bianca e sono in gran parte responsabili delle 
crisi epilettiche.
n Epilessia (prevalenza 92%): insorge a qualsiasi 
età ma raramente compare nel soggetto 
adulto, tipicamente non responsiva alle terapie 
farmacologiche tradizionali.
n Astrocitomi subependimali a grandi cellule 
(SEGAs) (prevalenza 15%).
Queste condizioni sono spesso associate a ritardo 
mentale, autismo ed altri problemi di tipo neuropsichiatrico.  Le lesioni presenti a 
livello della cute sono:
n Macchie ipomelanotiche (prevalenza 87-100%): possono essere presenti dalla 
nascita o comparire nel corso dell’infanzia; sono macchie bianche di forma 
poligonale o ad “Ash-leaf”, comuni sul tronco e dorso e rari in viso, ben 
riconoscibili con luce UV (lampada di Wood) e caratterizzate da una riduzione del 
numero di melanosomi accompagnata da una ridotta funzione melanocitaria.
n Angiofi bromi facciali (fi gura 2) (prevalenza circa 80%): più comuni dopo i 5 
anni e soprattutto in pubertà; 
sono papule rosso-rosa, bilaterali 
e simmetriche presenti su naso, 
guance e mento.
n Shagreen patches (prevalenza 
54-80%): rare nell’infanzia e più 
comuni dopo i 10 anni, spesso 
detti “collagenomi”.
n Fibromi ungueali e periungueali 
(prevalenza 52-88%): insorgono 
in genere dopo la pubertà.
Figura 2: Angiofi bromi facciali in genere 
benigni ma capaci di creare problemi 
psicologici nei pazienti.
Figura 1:Tuberi localizzati nella 
corteccia parietale che impediscono 
la corretta formazione delle 
interconnessioni cerebrali causando 
convulsioni e ritardo mentale.