La risposta anticorpale specifica per il virus di Epstein-Barr in pazienti affetti da sclerosi multipla e da altri disordini neurologici

L’isoelettrofocusing (IEF) è una tecnica elettroforetica ad alta risoluzione che ricerca la presenza di bande oligoclonali (BO) IgG nel LCS estratto attraverso la rachicentesi o puntura lombare. Le bande oligoclonali sono sottili strisce costituite da anticorpi appartenenti alla classe delle IgG che, insieme ad altre proteine, sottoposte ad una differenza di potenziale, migrano su un apposito gel di agarosio con pH variabile tra 3 e 10, fino a quando non raggiungono il valore di pH al quale la loro carica netta viene annullata (punto isoelettrico). In quella posizione “focalizzano” e si concentrano. Vengono poi trasferite (“blottate”) su membrana di nitrocellulosa e in seguito immunofissate con anticorpo specifico antimmunoglobuline umane (Ig) coniugato con perossidasi, per evidenziare le bande specifiche IgG. Il tracciato viene poi interpretato qualitativamente comparando la presenza/assenza delle bande oligoclonali nel siero e nel LCS. Il pattern di Ig liquorali deve essere sempre confrontato con quello delle Ig sieriche del paziente, per cui è necessario che sia il LCS che il siero siano studiati contemporaneamente in parallelo.
L’IEF veniva eseguito secondo il metodo precedentemente descritto da Luxton e colleghi nel 1990 (Luxton et al., 1990) utilizzando il kit commerciale per IEF IgG IEF dell’Helena Laboratories (Gateshead, Tyne and Wear, UK). Tutti i reattivi, anticorpi, substrato e soluzione bloccante erano inclusi nel kit.
In ogni pozzetto della piastra di gel di agarosio , venivano caricati 5 µl di campione: il siero diluito 1:300 e il liquor, opportunamente diluito se necessario, in base ai dosaggi di IgG ottenuti con la tecnica nefelometrica. I campioni prima di essere caricati venivano agitati con un apparecchio Vortex per alcuni secondi. Il gel veniva poi posto sulla camera di corsa del sistema IEF (Isolab) e la corsa IEF avveniva alle seguenti condizioni di alimentazione: V= 600; I=100mA; P= 10W; (kV)h=1.0. Al termine della corsa, dopo 60 minuti, il gel veniva “blottato” su nitrocellulosa per 30 minuti a temperatura ambiente. Dopo il trasferimento, si bloccavano poi i siti non saturati della nitrocellulosa ponendo questa in incubazione per 30 minuti con la soluzione bloccante, costituita da soluzione fisiologica al 2% di albumina bovina sierica (ABS). Trascorsi 30 minuti si sciacquava la nitrocellulosa con acqua distillata e la si metteva ad incubare a temperatura ambiente e in agitazione costante con 15 ml di soluzione di anticorpo specifico antimmunoglobuline umane (Ig) coniugato con perossidasi, diluito in soluzione fisiologica al 0,2% di ABS per 30 minuti. La nitrocellulosa veniva infine sciacquata 3 volte con acqua distillata e 1 volta con soluzione fisiologica e poi veniva messa ad incubare per 15-20 minuti con l’apposita soluzione substrato. Il bandeggio in IgG veniva rilevato sulla membrana, con un colore bruno rossiccio. Il risultato del LCS deve essere sempre associato a quello del siero. Molte patologie presentano bande IgG mono/oligoclonali. La SM presenta tipicamente IgG oligoclonali nel tracciato LCS ma non nel tracciato sierico. I profili venivano poi interpretati da due esaminatori indipendenti seguendo le linee guida del Consensus Europeo del “The Committee of The European Concerted Action for Multiple Sclerosis (Charcot Foundation) – Cerebrospinal Fluid European Consensus” (Andersson et al., 1994). Solitamente, su ogni gel, si utilizzavano un campione di LCS positivo per BO e un LCS negativo per BO, come controlli di riferimento.