Studio del ruolo della proteina Rab7 sulla crescita dei neuriti

Le colture cellulari rivestono una notevole importanza perché permettono di studiare l’attività cellulare in vitro.
Le cellule sono mantenute in coltura in piastre Corning, con terreno completo, ossia contente tutti i nutrienti necessari alla crescita delle cellule, in particolare:
sali minerali (per mantenere il pH e la pressione osmotica), amminoacidi, vitamine, glucosio, antibiotici e antifungini (contro la crescita di batteri e funghi che possono contaminarle), L-glutammina e siero fetale bovino, scomplementato a 56°C per 30 minuti (contenente fattori di crescita e di adesione). Queste colture vengono mantenute in incubatori a 37°C e ad una concentrazione di CO2 pari al 5%, al fine di mantenere il pH tra 7.2 e 7.4.
Le cellule usate in questi esperimenti sono:
· cellule Neuro 2A; cellule di neuroblastoma di topo della midollare del surrene, che crescono in monostrato aderendo al substrato.
Le Neuro 2A necessitano del terreno DMEM (Dulbecco's Modified Eagle's Medium) completo (Sigma), cioè contenente il 15 % di FCS (Fetal Calf Serum, siero fetale bovino; Sigma), privato del complemento a 56° C per 30 minuti, Lglutammina 100X (Sigma), penicillina e streptomicina (Sigma).
Quando le cellule in piastra raggiungono la confluenza vengono passate in altre piastre per mantenerle in coltura.
Il passaggio delle cellule prevede l’eliminazione del terreno vecchio e un lavaggio con PBS 1X (Phosphate Buffer Saline) per allontanare gli ioni bivalenti, che ostacolerebbero l’azione della tripsina; successivamente si elimina il PBS 1X e si aggiunge la tripsina (Sigma) 0.05% in EDTA: la tripsina è un enzima proteolitico che digerisce le proteine della matrice extracellulare che mediano l’adesione, permettendo la rottura dei legami cellula-cellula e cellula-piastra; si lascia agire per 3-5 minuti a 37°C, consentendole così di agire in modo ottimale solo su queste proteine e salvaguardando le altre proteine della cellula. Dopo si aggiunge terreno fresco e si spipetta sulla piastra. Successivamente si preleva un volume di questa sospensione dalla piastra madre e lo si riversa nella nuova piastra in cui è già presente del terreno completo fresco. Sulle nuove piastre si scrive il nome delle cellule, la data del passaggio, il numero del passaggio e la diluizione effettuata.
Il passaggio in mezzo fresco si effettua, generalmente, ogni 2-3 giorni. Le cellule non sono mai state utilizzate oltre il 25° passaggio al fine di evitare l’accumulo di mutazioni nel genoma (fenomeno della senescenza cellulare).