Mutazioni nel gene del collagene 7 (col7a1) in pazienti italiani affetti da epidermolisi bollosa distrofica: correlazione genotipo-fenotipo

In questo lavoro sono stati analizzati 9 pazienti affetti da EBD. Sei pazienti erano affetti dalla forma grave di EBDR (variante di Hallopeau-Siemens), due pazienti erano affetti dalla forma lieve non HS -EBDR loc e uno presentava un quadro clinico compatibile con la forma dominante di EBD (EBDD); L’analisi dei “pedigrees” dei pazienti EBDR ha mostrato che sei pazienti su nove erano i soli individui affetti dalla patologia nella propria famiglia e che il paziente 8 aveva un fratello anch’esso affetto da non HS ­EBDR loc.

Analisi di mutazioni in COL7A1 in pazienti EBD
Dal momento che nei pazienti EBDR italiani la mutazione 497insA è frequente (Christiano et al., 1996d, Gardella et al., 1999), abbiamo dapprima proceduto analizzando il DNA genomico dei pazienti EBDR per la presenza di questa mutazione, utilizzando come metodica di “screening” l’amplificazione allele-specifica ASA-PCR (“Allele Specific Amplification”­PCR). L’analisi è stata eseguita utilizzando un “primer” diretto specifico per l’allele normale o un “primer” diretto specifico per l’allele mutato in combinazione con un “primer reverse” comune (Materiali e Metodi). L’amplificazione con il “primer” diretto normale dà un prodotto solo se è presente l’allele “wild-type”, mentre l’amplificazione con il “primer” mutato dà un prodotto solo se è presente l’allele mutato. La conferma della mutazione si è ottenuta mediante sequenziamento diretto del frammento di DNA genomico amplificato contenente la mutazione.
Nei pazienti in cui questa mutazione non è stata identificata èsi è proceduto amplificando l’intero cDNA del COLVII, utilizzando 22 coppie di “primer” e verificando dapprima le dimensioni dei frammenti amplificati su gel d’agarosio .Successivamente analizzati prodotti di PCR sono stati analizzati su gel MDE.