Effetto dei promotori di tumori su proteine cinasi attivate da mitogeni

La cancerogenesi è un processo a più stadi che comprende diversi eventi indipendenti (1, 72). Le alterazioni che ne conseguono si manifestano con lo scardinamento dei circuiti omeostatici che mantengono le cellule in uno stato di equilibrio con l'ambiente esterno e ne permettono la normale funzionalità.
Le cellule neoplastiche possiedono particolari caratteristiche fenotipiche come, ad es., la diminuzione dei caratteri differenziativi e della normale organizzazione istologica, l'aumento della proliferazione associato alla perdita dell'inibizione da contatto, la capacità di invadere i tessuti adiacenti e di insediarsi in distretti dell' organismo distanti dal luogo d'origine delle cellule neoplastiche in attiva proliferazione, con la formazione di metastasi.

Diverse osservazioni sperimentali, basate su modelli animali (73, 74) e su colture cellulari (73, 75), hanno dimostrato che la cancerogenesi è un processo sostenuto da una mutazione somatica a carico delle cellule, che vanno incontro alla trasformazione neoplastica. Si è visto tuttavia che una singola alterazione genetica raramente è sufficiente per conferire alla cellula trasformata la proprietà della tumorigenicità, che generalmente si manifesta in seguito a lesioni genetiche multiple (73), che si aggiungono alla mutazione iniziale, dando alla cellula trasformata caratteristiche proliferative più "aggressive". Queste stesse ricerche hanno portato alla conclusione che lo sviluppo tumorale non sia costituito da un unico passaggio ma sia un fenomeno complesso, a più stadi qualitativamente diversi (72, 73). Si parla, quindi, di cancerogenesi multifasica per indicare che la generazione e lo sviluppo del cancro avvengono in più fasi.

La cancerogenesi multifasica viene generalmente divisa in tre tappe, definite iniziazione, promozione e progressione (72, 73). L'iniziazione consiste nella interazione della cellula con un agente cancerogeno, in seguito alla quale la cellula normale si trasforma in cellula "iniziata" cioè irreversibilmente alterata anche se in modo latente. La promozione consiste nell'espansione clonale della cellula iniziata associata all'espressione del fenotipo trasformato. La cellula iniziata, quindi, è più aggressiva e prolifera in modo rapido e incontrollato. La progressione consiste infme nella acquisizione di ulteriori mutazioni geniche, che inducono estese alterazioni fenotipiche nella popolazione di cellule iniziate, con un conseguente aumento dell' aggressività del tumore che porta poi generalmente alla diffusione metastatica della neoplasia.

Iniziazione tumorale
Gli agenti che inducono la cancerogenesi (iniziatori) possono essere fisici o chimici.
Tutti gli agenti cancerogeni, comunque hanno in comune la proprietà di interagire con gli elettroni del guscio più esterno di svariate molecole, alterandole. Quando l'alterazione è a carico del DNA, il danno genico, non riparato, è causa di un'alterazione irreversibile. Gli agenti cancerogeni possono produrre, in certi casi, un danno letale inducendo la morte della cellula (76). In altri casi, gli effetti dell'interazione non sono letali e la cellula, defmita cellula iniziata, sopravvive e prolifera (73, 76).
Alcuni bersagli genetici degli iniziatori, sono rappresentati dai cosidetti proto-oncogeni (77) che codificano componenti di sistemi di trasduzione dei segnali che controllano la funzionalità cellulare, quali proteine cinasi (per es. Src, Abl), proteine G (per es. Ras), fattori di crescita (per es. Sis), fattori di trascrizione (per es. Myc, Fos, Jun), recettori per fattori di crescita (per es. RPTK) ecc.. Nella cellula normale questi proto-oncogeni sono necessari in momenti precisi, come per es. durante lo sviluppo oppure per la normale regolazione della funzionalità della cellula. Si ritiene che i cancerogeni inizianti inducano mutazioni nei proto-oncogeni, la cui espressione determina il fenotipo trasformato della cellula in quanto il loro prodotto è costituito da una proteina alterata, ovvero è espresso a livelli anormali (77, 78). A seconda della mutazione a cui va incontro l'oncogene può essere sempre espresso, costitutivamente attivo, oppure la proteina che ne deriva può essere presente in quantità maggiore rispetto al normale. Queste proteine alterate qualitativamente e/o quantitativamente porterebbero quindi la cellula ad uno scardinamento dei meccanismi di controllo della sua funzionalità, che si risolve in una proliferazione incontrollata e/o in un differenziamento anomalo.
Altri geni bersaglio dei cancerogeni chimici sembrano essere i gem receSSIVI, sopresson del cancro, defmiti anche anti-oncogeni, come Rh (79). Alcuni tumori possono, quindi, derivare non dall'attivazione di geni che promuovono la proliferazione (oncogeni) ma dalla inattivazione di altri che, in condizioni normali, la sopprimono (geni sopressori di tumore) (80, 81). I geni sopressori di tumore sarebbero quindi coinvolti nella trasformazione neoplastica nel caso in cui la loro funzione venisse persa oppure compromessa. Questo si può verificare quando una delezione elimina parzialmente o completamente la sequenza genica del sopressore tumorale, oppure quando una mutazione rende non funzionale il suo prodotto. li fenotipo trasformato si presenta così solo in caso di omozigosi, cioè solo quando entrambi gli alleli di un certo anti -oncogene sono alterati o persi.
Perché avvenga l'iniziazione, comunque, le cellule alterate dal cancerogeno devono subire almeno un ciclo proliferativo, in modo che la modificazione del DNA si "fissi" e diventi permanente. Fino a quando non si verifica l'evento proliferativo, infatti, gli enzimi di riparazione possono ancora intervenire per correggere la mutazione, che diventa invece irreversibile dopo che il DNA è stato duplicato.

Promozione tumorale
Le cellule iniziate possono dare ongme a tumori quando, stimolate con agenti promoventi, danno l'espansione clonale (82).
I promotori tumorali sono sostanze che generalmente non sono, di per sé, cancerogene ma sono capaci di potenziare l'effetto di agenti iniziatori in quanto favoriscono la propagazione della mutazione da essa indotta, stimolando la proliferazione delle cellule (52, 82).
Questi composti possono essere classificati in:
• Promotori tumorali del tipo degli esteri del forbolo
• Promotori tumorali del tipo dell'acido okadaico

Gli esteri del forbolo sono i promotori tumorali più usati negli studi di cancerogenesi chimica (73). Questi composti possono indurre un fenotipo simile a quello delle cellule trasformate (76), legandosi selettivamente e attivando alcuni isoenzimi della proteina cinasi C (Figura 4) (82, 83). La capacità degli esteri del forbolo di attivare questi lsoenz1Illl SI basa sulla sua somiglianza strutturale (nell' occupazione dello spazio) al diacilglicerolo che attiva fisiologicamente la cinasi (82, 83). In questo modo il TPA, attivando la PKC, dà il via ad una cascata di fosforilazioni proteiche che altera la funzione di recettori associati alla membrana, di canali ionici, di proteine citoplasmatiche e di proteine nucleari, inducendo la proliferazione e modulando il differenziamento cellulare (76). La base molecolare della promozione dei tumori da parte di componenti del tipo degli esteri del forbolo, sarebbe quindi la stimolazione della fosforilazione di proteine dovuta, direttamente o indirettamente, alla PKC. In riferimento alla proliferazione cellulare, in particolare, la trasduzione del segnale degli esteri del forbolo seguirebbe la cascata fosforilativa descritta nella figura 4 coinvolgente, in sucessione, la PKC, Rafl, MEK ed ERK, secondo il meccanismo mole colare già descritto nei paragrafi 1.2 e l.3 (47).
La classe dei promotori tumorali diversi dagli esteri del forbolo, comprende tutti quei componenti che, come l'acido okadaico (AO), sono in grado di legare e inibire le PPasi seriniche/treoniniche 1 e 2A (Figura 4) (22, 84). In conseguenza di questo blocco della defosforilazione, i substrati di PP 1 e PP2A vengono stabilizzati nella forma fosforilata.
Nel modello di cancerogenesi cutanea a due fasi (iniziazione•promozione) componenti come l'AO o la caliculina A mostrano di essere tanto potenti quanto un estere del forbolo come il TPA (o 12-0•tetradecanoilforbolo-13 -acetato) (72, 85), pur utilizzando un meccanismo molecolare d'azione differente.

Diverse classi di proteine possono essere defmite bersagli di AO e degli altri membri della stessa classe di promotori tumorali. Queste comprendono tutte quelle proteine che vengono generalmente defosforilate da PP1 e PP2A. Per esempio, ERK1 ed ERK2, p38, un'altra proteina cinasi appartenente alla famiglia delle MAPK che viene fosforilata da una cascata di fosforilazioni parallela a quella delle ERK, e p90 Rsk, una proteina cinasi ser/thr attivata dalle ERK e in grado, come ERK1 e 2 di regolare l'attività di fattori di trascrizione necleari e la proliferazione cellulare (3, 70, 86, 87).
Un altro gruppo di bersagli dei composti della classe dell' AO possono essere anche i fattori di trascrizione (FT), ovvero altre proteine capaci di interagire con FT, controllandone le funzioni (88). Fra i primi vi è il cosiddetto fattore di risposta al siero (SRF da Serum Response Eactor) che è mantenuto allo stato fosforilato dalI'AO (88).

Oltre all'azione su proteine capaci di stimolare la proliferazione cellulare, i composti della classe dell' acido okadaico possono agire anche su proteine inibenti la proliferazione stessa come per es. Rb e p53. Queste proteine possono essere inattivate dalla fosforilazione (89, 90) per cui il blocco della defosforilazione operato dall' AO (91, 92) le manterrebbe in una forma inattiva favorendo la proliferazione.
In conclusione, diversamente dalle sostanze inizianti, le modificazioni cellulari che si hanno in seguito all'applicazione di agenti promotori appaiono reversibili (72). Questi, infatti, non danneggiano generalmente il DNA e la loro azione è essenzialmente epigenetica, determinando a livello cellulare un' alterata espressione
genica (72). La promozione è quindi un fenomeno epigenetico che coinvolge il cambiamento dell'espressione di geni fra i quali possono essere compresi quelli che sono stati già mutati dall'iniziatore. La manifestazione fenotipica della mutazione iniziale è così dovuta al fatto che i promotori stimolano la proliferazione clonale delle cellule iniziate, di cui possono anche alterare il differenziamento (76, 82).

Progressione tumorale
La maggior parte dei ricercatori ritiene che la trasformazione neoplastica sia associata all'acquisizione di una instabilità genetica (93). Questo rende la cellula suscettibile di un alto numero di mutazioni casuali, che si verificherebbero durante l'espansione clonale e che si sommano alla mutazione della cellula iniziata. La progressione tumorale consiste, in defmitiva, nel passaggio da un tumore più differenziato e poco aggressivo ( come possono essere i tumori benigni), a un tumore sempre meno differenziato e più aggressivo (come sono i tumori maligni). Durante questo processo il tumore tende ad arricchirsi soprattutto di quelle cellule che, perdendo caratteri differenziativi e regolatori della proliferazione, sono più adatte alla sopravvivenza, alla moltiplicazione, all'invasione di tessuti circostanti e alla metastatizzazione.