Reattori sequenziali a doppia fase per la rimozione biologica di composti xenobiotici. Caso di studio: 4-nitrofenolo.

Per poter ottimizzare il funzionamento del reattore e conoscerne meglio la composizione, la comunità batterica presente è stata monitorata costantemente in termini di abbondanza e diversità.
Per quanto riguarda la quantità di biomassa presente, essa è stata periodicamente stimata attraverso una misura dei solidi sospesi totali (vedi paragrafo 2.1).
Per lo studio della struttura della comunità microbica, invece, ci si è basati sull'analisi della sequenza dell'RNA ribosomiale (rRNA).
Nei procarioti i geni per l'rRNA 16S, 23S e 5S sono riuniti in un unico operone policistronico. Tra i geni per gli rRNA sono presenti regioni spaziatrici (ISR) che contengono un numero variabile di tRNA.
Durante la trascrizione, quindi, i tRNA e gli rRNA sono co-trascritti a partire da due promotori, P1 e P2, formando lunghe molecole di pre-rRNA.
Queste molecole vengono poi tagliate da una RNasi per dare origine agli rRNA maturi.
In questo processo, assumono particolare importanza le regioni spaziatrici ISR, che, possedendo delle sequenze invertite ripetute, assumono una conformazione ad ansa, necessaria affinché la reazione avvenga correttamente.
Poiché queste regioni spaziatrici sono altamente conservate, vengono utilizzate, insieme alla sequenza che codifica per l'rRNA 16S, per le analisi filogenetiche.
Una volta che il preRNA è stato tagliato, l'ultimo passaggio per l'attivazione biologica degli rRNA consiste nella formazione di complessi rRNA-proteine e nell'azione di altre ribonucleasi che tagliano alcuni residui terminali della molecola.
Grazie all'esistenza di numerosi database in cui sono riportate informazioni sulla sequenza genica degli rRNA microbici è stato possibile, per prima cosa, condurre studi filogenetici, e, successivamente, identificare i batteri utilizzando sonde marcate che legano l'rRNA.
Le molecole di rRNA rappresentano il target ideale per questa applicazione in quanto sono distribuite in grande quantità all’interno delle cellule e possiedono sia regioni altamente conservate, sia sequenze con variabilità interna che permettono di discriminare tra famiglie, generi e specie.
La tecnica si basa sull’utilizzo di sonde oligonucleotidiche (15-30 nucleotidi) fluorescenti specifiche per l’rRNA.
Le sonde presentano all’estremità 5’ un fluorocromo colorato o fluorescente legato covalentemente che può essere, ad esempio, una carbocianina marcata, come Cy3 e Cy5, oppure fluoresceina o una tetrametilrodamina (Southwick et al., 1990).
Le sonde, messe a contatto con i campioni precedentemente trattati con fissativi chimici e deidratati in soluzioni con concentrazione crescente di etanolo, penetrano nelle cellule e legano le sequenze complementari con legami idrogeno. Ogni sonda ha una diversa capacità di legare le sequenze complementari che è definita stringenza e sulla quale si può intervenire variando le condizioni di temperatura, concentrazione salina e concentrazione di formammide.
Una volta legata, la sonda viene visualizzata con un microscopio ad epifluorescenza.
Grazie a questa tecnica, è possibile monitorare in situ le dinamiche di popolazioni microbiche, in tempi brevi (3-4 ore).
Di solito, si parte da una caratterizzazione più generale, con sonde per Eubacteria e Archea, per poi passare, se necessario, ad un’analisi più specifica.