Il sistema adenosinico: principali targets molecolari ad attività anti-tumorale

L’interazione di specifici ligandi con i recettori di morte rappresenta la prima tappa della pathway di segnali cellulari che caratterizzano la via apoptotica di tipo “estrinseca”. Il legame di TRAIL con i recettori DR4 e DR5 determina un cambiamento conformazionale a livello dei domini DD (Death Domain), che porta all’attivazione funzionale dei recettori. I cambiamenti conformazionali indotti dall’attivazione consentono ai recettori di morte di reclutare FADD (Fas-associated protein with deth domain), una molecola adattatrice che ha un ruolo cruciale nella formazione del complesso di morte DISC (Death-inducing signaling Complex) (Klichkel et al., 1995).

In qualità di molecola adattatrice, FADD è in grado di reclutare e contemporaneamente di attivare, mediante i domini DED (Death Effector Domain) le pro-caspasi iniziatrici -8/-10, completando in tal modo, l’assemblaggio del complesso DISC (Medema et al., 1997). Alternativamente in cellule di tipo II (Ozoren and El-Deiry, 2002), ovvero in cellule in cui l’attivazione recettoriale della caspasi-8 è limitata, TRAIL può servirsi della via apoptotica mitocondriale. Le caspasi iniziatrici attivate, infatti, sono in grado di clivare ed attivare Bid (BH3-interacting domain death agonist), un membro pro-apoptotico della famiglia Bcl-2 (B-cell CLL/lymphoma 2).

Tuttavia in base al tipo cellulare, tBid può dar inizio alla via apoptotica intrinseca o mitocondriale nel caso si tratti di cellule di tipo II, o semplicemente amplificare la signaling della via estrinseca (ovvero dipendente dall’attivazione recettoriale), se si tratta di cellule di tipo I. Nella sua forma tronca tBid, da inizio alla via apoptotica mitocondriale mediante l’interazione con le proteine BAX (Bcl-2-associated X protein) e BAK (Bcl-2 homologous antagonist killer), favorendone la loro oligomerizzazzione e traslocazione sulla membrana mitocondriale esterna. Una volta localizzato sulla membrana mitocondriale, il dimero BAXBAK determina un’alterazione del potenziale di membrana mitocondriale, con formazione di pori di grandi dimensioni (MOMP) (Waterhouse et al., 2002) che consentono l’esternalizzazione di molecole pro-apoptotiche normalmente localizzate nello spazio intermembrana del mitocondrio. Il citocromo c è una proteina solubile che rappresenta un elemento essenziale della catena mitocondriale di trasporto di elettroni; è normalmente situato nello spazio intermembrana ed è debolmente legato alla superficie interna della membrana mitocondriale.

Nel corso del processo apoptotico il citocromo c è rilasciato nel citoplasma ed innesca la cascata delle caspasi (Liu et al., 1996). Una volta rilasciato nel citosol il citocromo c interagisce con la proteina Apaf-1 (apoptosis protease-activating factor 1) partecipando alla formazione di un complesso multimerico formato dallo stesso citocromo c, da dATP e dalla caspasi-9, conosciuto come apoptosoma (Cain et al., 2000). Il legame del citocromo c determina un cambiamento conformazionale in Apaf-1, che consente alla molecola di esporre il dominio CARD (caspase-recruitment domain), la cui funzione è quella di reclutare ed attivare la procaspasi-9 in caspasi-9. In condizioni normali Apaf-1 lega solo debolmente l’ATP, nonostante la presenza della sequenza consenso di walker per il legame dei nucleotidi;tuttavia l’interazione del citocromo c ne aumenta l’affinità (Jiang and Wang, 2000).

Una volta attiva la caspasi-9 attiva le caspasi effettrici -7 e -3 dando inizio alla cascata proteolitica. Smac/DIABLO (second mitochondrial derived activator of caspase) è una proteina mitocondriale di 25 KDa, di origine citosolica, che presenta all’estremità N-terminale una sequenza segnale di 55 aminoacidi; tale sequenza è rimossa quando la proteina giunge nei mitocondri e si genera la forma Smac matura (che presenta una nuova sequenza Nterminale), che è collocata nello spazio intermembrana (Du et al., 2000). I primi quattro amminoacidi della proteina Smac, Ala-Val-Pro-lle (AVPI), si legano al dominio BIR (Baculovirus IAP [inhibitor of apoptosis protein] repeat) (Chai et al., 2001). Le proteine IAP sono una famiglia di proteine intracellulari che inibiscono la caspasi nella forma attiva; tali proteine presentano uno o più domini BIR che chelano ioni zinco in una configurazione simile ai motivi a dita di zinco. Sono state identificate nei mammiferi sei proteine contenenti domini BIR (BIRP, BIR containing proteins): IAP (inhibitor of apoptosis) -1 e -2, XIAP (X-linked inhibitor of apoptosis), NIAP (neuronal inhibitor of apoptosis), BRUCE (BIR-repeat-containing ubiquitin-conjugating enzyme) e survivina. La sequenza amminoacidica con la quale Smac si lega ai domini BIR3 di XIAP è identica a quella con la quale la caspasi-9 attiva interagisce con XIAP; la sequenza che lega IAP è esposta solo dopo il clivaggio proteolitico della caspasi-9.

Gli effetti inibitori delle IAP nei confronti delle caspasi vengono neutralizzati dalla proteina Smac, la quale interagendo col dominio BIR2, forma un complesso stabile con le IAP, che mediante ingombro sterico, destabilizza il legame tra caspasi e IAP favorendo il rilascio della caspasi attiva e la degradazione proteosomica delle IAP (Chai et al., 2001). L’abilità di Smac di controbilanciare l’azione inibitoria delle proteine IAP, rappresenta uno dei meccanismi chiave del processo apoptotico. Infatti nonostante il rilascio del citocromo c, se i livelli citosolici delle IAP sono particolarmente elevati, l’apoptosi mitocondriale non ha luogo. Tuttavia, poiché la via intrinseca ed estrinseca convergono a livello dell’attivazione della caspasi-3, elevati livelli di IAP come XIAP, possono inibire anche la morte cellulare mediata da recettori di membrana (Yang et al., 1998; Suzuki et al., 2001).

HtrA2/Omi è una molecola appartenente alla famiglia delle proteasi a serina che è in grado, una volta rilasciata nel citosol, di incrementare significativamente l’attività delle caspasi, attraverso l’inibizione diretta delle IAP mediante clivaggio proteolitico (Hedge et al., 2002). AIF (apoptosis inducing factor) è una flavo proteina di 57 kDa che è in grado di indurre la degradazione del DNA in maniera caspasi-indipendente, in maniera indiretta (in quanto priva di attività nucleasica) mediante l’azione nucleasica di una seconda proteina non ancora identificata (Susin et al., 1999). L’ Endonucleasi G (EndoG) è una nucleasi di 30 kDa, tradotta nel citosol e traslocata nel mitocondrio. Consente all’apoptosi di procedere anche in assenza di attività caspasica quando i mitocondri sono danneggiati. EndoG, come AIF, è in grado di indurre la condensazione della cromatina e la frammentazione del DNA. In questo caso AIF ed EndoG danno inizio ad un programma apoptotico parallelo a quello dell’attivazione delle caspasi (Widlak et al., 2001).