Sviluppo di una DNA microarray per la rilevazione di microrganismi decloruranti in matrici ambientali contaminate da composti organici policlorurati

Come primo passo è stata compilata una lista di microrganismi di cui è stata dimostrata in studi precedenti l’attività di dealorespirazione.
Utilizzando il programma ARB (Ludwig et al., 2004) è stata valutata la correlazione filogenetica dei microrganismi target, basandosi sulla percentuale di identità di sequenza tra i geni codificanti per l’rRNA 16S. Oltre ad un albero generale comprendente tutti i phyla, utile per un quadro di insieme, sono stati creati alberi filogenetici per ogni phylum che comprende al suo interno specie decloruranti, così da avere informazioni più dettagliate.

Il database del programma è stato integrato con i dati presenti in RDP-II (Ribosomal Database Project II) (Cole et al. 2007, Wang et al. 2007). Utilizzando lo strumento Hierarchy Browsers è controllato il valore numerico di sequenze presenti nella banca dati di RDP-II per ciascun positive set dell’ENVIRONMENTAL MICRO(BI)ARRAY.

I criteri di ricerca scelti sono i seguenti:
- Strain: “Both”. Nella ricerca venivano considerati sia i ceppi type che quelli non type di ciascuna specie.
- Source: “Isolates”. Nella ricerca vengono considerate esclusivamente le sequenze di ceppi isolati.
- Size: “≥1200 bp” . Nella ricerca vengono considerate esclusivamente sequenze maggiori o uguali a 1200 paia di basi.
- Quality: “Good”. Nella ricerca vengono considerate solo sequenze a basso numero di basi degeneri.

In base alle informazioni ottenute dagli alberi filogenetici, sono stati scelti i positive set, cioè le sequenze o i gruppi di sequenze bersaglio dell’ENVIRONMENTAL MICRO(BI)ARRAY: singole sequenze, se nello stesso nodo del microrganismo declorurante di interesse sono presenti batteri non decloruranti, o gruppi di sequenze (cluster), di solito appartenenti a specie dello stesso genere, se nel nodo dell’albero filogenetico sono presenti tutte e solo specie decloruranti. Per ogni cluster è stata creata una sequenza consensus che è stata utilizzata per il successivo disegno delle sonde. I positive set sono quindi costituiti da singole sequenze nel caso il target sia un singolo microrganismo o da sequenze consensus nel caso in cui il target sia un gruppo di specie decloruranti strettamente correlate filogeneticamente.

Per ogni positive set è stato selezionato un negative set, l’insieme delle sequenze che non devono essere riconosciute dalla sonda perché appartenenti a specie non decloruranti o a specie decloruranti comprese in altri positive set. Come gamma di sequenze per il negative set è stato preso in considerazione l’insieme delle sequenze della classe o dell’ordine tassonomico a cui appartiene il microrganismo che costituisce il positive set, a seconda della quantità di dati a disposizione per avere una sufficiente rilevanza statistica. Per ogni negative set è stata creata una sequenza consensus.